CT 灌注成像技术对犬肝纤维化模型的实验研究*

靳秀丽，杨汉丰，蒋世明

(1.川北医学院附属医院CT 室;2.南充市中心医院CT 室，四川 南充 637000)

肝纤维化(hepatic fibrosis)是机体对慢性肝损伤的一种修复反映，也是进一步向肝硬化发展的主要的中间环节。研究表明，肝纤维化不仅是引起肝功能障碍和肝硬化的病理基础，也是造成门脉高压的重要始动因素。肝纤维化过程中以肝内纤维生成与降解失衡，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积为特征［1－2］。

肝脏CT 灌注成像(CT perfusion imaging，CTP)的概念是Miles 等于20 世纪90 年代初提出的，是一种在活体上无创性评价组织、器官血流灌注状态的新方法。肝脏灌注是指肝动脉和门静脉将氧气和其他物质输送给肝组织并加以利用或转化的过程，一般将之等同于血流过程。

本研究的目的就是通过对不同病理阶段肝纤维化犬行肝脏CT 灌注扫描及选取CT 灌注感兴趣区处的肝脏组织行肝穿活检，动态观察其灌注参数的变化，分析其血液动力学改变及病理基础，探讨其灌注参数变化的规律，以期深入的研究肝纤维化、肝硬化的生化、病理学的变化。

1 材料和方法

1.1 动物分组与模型制作

1.1.1 实验动物与分组:14 只两岁beagle 犬(由简阳动物繁殖中心提供)，雄性，体重:(14 ±2)Kg，经体格及实验室检查、B 超提示没有肝肾脾脏疾病。随机分成两组，实验组10 只，正常对照组4 只。

1.1.2 肝纤维化模型制作:实验动物在动物中心按标准方法饲养，即每天每只给予200g 颗粒饲料。实验组以10%乙醇(由无水乙醇与蒸馏水按1∶9 比例混合)作为饮料，不饮水，对照组自由饮水。将菜籽油溶液(益海粮油有限公司生产)与分析纯ccl4 溶液(四川科伦制药有限公司)等容积混合制备成50% ccl4 油溶液待用，按每公斤体重0.12mL 剂量腹腔注射，每3 －4 天注射1 次，每周2 次，共注药8－10 周。加药期间严密观察笼内有无呕吐物，进食速度和剩余饭量以观察食欲，散放动物观察毛色、精神状态及活动度。于加药的双周末称体重、行CT平扫及CT 灌注扫描、测量肝脏体积、进行肝穿刺活检以做病理检查。

1.2 beagle 犬CT 灌注扫描方法

1.2.1 扫描前准备:实验犬扫描当日禁食8 小时，禁饮6 小时，取仰卧位，术区备皮、消毒，肘静脉建立静脉通道。行全身麻醉(使用丙泊酚3ug/Kg，司克林1mg/Kg，芬太尼3ug/Kg 静脉推入)，待试验犬麻醉满意后，放置气管插管并连接固定好即可行CT 扫描。

1.2.2 肝脏的CT 灌注成像

1.2.2.1 使用东芝16 层螺旋CT 机。扫描条件为:120Kv，100mA，层厚为7mm，扫描时间为6 秒。平扫应为包括全肝的容积扫描，根据平扫图形选取扫描范围。灌注测量标准层面以能同时清晰显示肝脏、主动脉及门静脉、脾脏区域为标准灌注扫描层面。

1.2.2.2 将非离子型造影剂碘海醇(300 mg I/ml，扬子江药业集团公司，)按照1.2ml/Kg 体重，7ml/s的速度经肘静脉高压快速团注注入。

1.2.2.3 灌注扫描层厚2mm ×12mm。每层扫描时间为1 秒，每间隔1 秒重复扫描，扫描时相包括动脉期及门静脉期，持续约120 秒。

1.3 图像处理与分析

将扫描图像分别传入工作站及个人电脑，使用basama Perfusion3.2 0.1 分析软件测定肝灌注参数包括肝总血流量(total liver perfusion ，TLP)、肝动脉血流量(hepatic artery perfusion，HAP)、肝门静脉血流量(hepatic portal vein perfusion，HPP)及肝动脉灌注指数(hepatic perfusion index，HPI)并得到灌注彩图(图1 －4)。各灌注参数值测量两次，取平均值后记录各项参数。

在感兴趣区的范围选择上，应遵循如下原则:①选取尽可能大的感兴趣区范围;②避开明显的血管、脂肪及钙化，避免出现部分容积效应;③选取的感兴趣区经多层面对照适当调整位置及范围。

2 结 果

对照组0 －10 周肝脏组织病理表现正常。实验组双周末肝脏的组织病理学变化如表1。造模共计10 周，总共有5 只造模成功(八周时1 只造模成功，这只犬不再加药，十周时有4 只造模成功)，2 只死亡。其中，死亡动物尸检报告显示多由于腹膜、呼吸系统感染所致。剩余的3 只未造模成功不纳入统计范围。

表1 实验组0 －10 周病理变化(单位:例)

大体所见正常犬肝脏表面光滑，色泽均匀暗红，分成5 －8 叶不等，质地柔软。实验组随着肝纤维化的程度加重，肝脏呈灰白色，无光泽且质地变硬。肝纤维化造模过程中双周末行CT 引导下肝脏穿刺活检并HE 染色病理改变如图1 －图5。

将对照组和肝纤维化组内的不同纤维化程度进行多均数的比较采用因素方差分析(One-Way ANOVA)，统计各组间及组内的统计学差异，如表2。

3 讨 论

3.1 肝纤维化动物模型的造模原理

国内外有关肝纤维化动物模型已有相关的报道，但多数采用的是小鼠、家兔等小动物［3－5］，而与人类更为接近的大型动物的肝纤维化模型文献报道较少。本实验采用与人生理特点较接近的beagel 犬作为实验对象，建立起肝纤维化模型，动态观察实验过程中各灌注指数、肝脏体积、生命体征及肝组织的病理变化，以期深入的研究肝硬化的生化、病理学的变化特点。

表2 肝纤维化组不同肝纤维化程度的肝脏灌注参数的比较

ccl4中毒性肝纤维化动物模型是一种经典的肝纤维化造模方法［6－8］，其机理主要是ccl4能溶解肝细胞膜上的脂质成分，同时也影响肝细胞的细胞色素P45O 依赖型混合功能氧化酶的代谢，致肝细胞损伤、变性、坏死，长期反复刺激可造成肝纤维化、肝硬化的形成。无水乙醇均能诱导P45O 的活性从而增加ccl4的肝毒性，加速肝细胞的变性和坏死，从而使肝硬化形成的时间更短［6，9］，吴孟超等［10］采用ccl4+无水乙醇造模，小鼠60 天即可形成肝硬化。通过本实验，我们认为ccl4腹腔注射加饮食控制是一种非常有效的肝纤维化造模方法。

3.2 CT 灌注成像对肝纤维化的诊断价值

本实验中，肝动脉的灌注量总体呈上升趋势，以维持TLP，S0 －S4 期HAP 与正常对照组相比较无统计学差异。本研究结果与Blomley［11］和Tsushima［12］的结果相似。肝纤维化时肝动脉虽然有缓冲功能，但不像我们想象的那样强大，它不能弥补肝纤维化所致的门脉灌注值的下降。Van Beers 报道，肝动脉灌注在肝硬化组，慢性肝病组及正常对照组间差别有统计学意义;在guan［13］等的动物试验中，肝动脉灌注量也有统计学意义。本研究中HAP 无统计学意义的可能原因有:①动物模型与人类发生肝纤维化的发生机理不同;②设备技术原因，实验犬采用全麻方式消除呼吸运动的影响，而在肝纤维化、肝硬化患者，灌注扫描时不可能采取全麻的方式，也就不可能能完全消除呼吸运动的影响。

就HPP 而言，S1，S2 期肝脏的门脉灌注值较对照组有下降，但在S1 与S2 组间无统计学差异，这可能与此阶段肝纤维化的程度还较轻，肝脏还可通过自身的调节机制来补偿血流灌注。S3，S4 期较S0，S1 期HPP 下降明显(p ＜0.05)，而在S3，S4 组间无统计学差异。可能是肝小叶结构破坏和改建、大量的胶原纤维沉积，门静脉分支受压变窄;肝窦毛细血管化，也可使门静脉及分支受压，上述改变最终导致门脉高压形成。本实验结果表明随着肝纤维化程度的加重，HPP 会逐渐降低，且重度肝纤维化时HPP与正常对照组有统计学差异。本研究与Nakashige［14］的研究结果有相似性。我们认为肝动脉的缓冲功能存在较大的个体差异，而且有一定的限度。可能与以下因素有关:①肝纤维化时期，HPP 下降还没有达到肝动脉缓冲的时候［15］。根据Richter等［16］的实验，门脉血流量下降至60%才能观察到。我们的观察对象均是肝纤维化的不同时期及肝硬化早期，门脉灌注量还不足以下降到60%，也就很难被观察到统计学差异的肝动脉缓冲及HPP 在不同程度肝硬化组内的统计学差异。②本研究采用的是斜率法，该方法假设组织器官时间密度曲线的初始最大斜率在这段时间内没有静脉流出，而肝纤维化晚期及肝硬化，肝内存在门腔分流及侧支循环建立，所以可能会过低估计门脉血流量。③注射流率和对比剂浓度可能对其也有一定影响［17］，所以有待加大样本量进一步研究。

在本研究中TLP 与对照组相比较，在S0 － S4间无统计学差异，但仍可看出其值似在降低。这说明随着肝纤维化程度的加重，肝脏的血液供应在逐渐减少，这与肝纤维化程度加重的病情相吻合。

与对照组相比较，随着肝纤维化程度的加重，加药时间的延长，肝脏的灌注指数呈上升趋势。S3，S4期肝脏灌注指数与S0，S1 期HPI 相比较明显升高，有统计学差异，S0 与S1 之间，S3 与S4 间比较无统计学差异。这一结果说明随着肝纤维化程度的不断加重，尤其在肝纤维化的后期，肝脏血流逐渐动脉化，肝动脉的血流灌注量占TLP 的比重在明显上升，这与肝动脉的代偿能力及肝脏血流的再分配有一定的关系，肝动脉的代偿缓冲能力是有一定限度的，况且存在个体差异，因此，在评价HAP 对TLP 的贡献率时，要考虑到肝脏灌注指数是一个相对值，受HAP 和HPP 的双重影响。并且，HPP、HPI 在肝纤维化的检测中可作为较为敏感的指标。

肝脏CT 灌注成像作为一种无创性的功能成像方法，能在肝脏组织发生形态学改变之前，通过对各个灌注指数的分析，从而定量分析肝纤维化时肝脏微循环状态及变化，以及评价肝纤维化轻重程度，对于评价肝脏的储备功能是一种较为敏感的方法。

［1］ Bataller R，Brenner DA.Liver fibrosis［J］.Clin Invest，2005，115(2):209 －218

［2］ Safadi R，Friedman SL.hepatic fibrosis － role of hepatic stellate cell activation［J］.Med Gen Med，2002，4(3):27

［3］ 马春梅.CT 灌注成像在兔肝纤维化模型的研究［J］.中国医学影像技术，2007，(23)5:641 －644

［4］ 吴孟超，杨广顺.大鼠肝硬化模型复制的研究［J］.中华实验外科杂志，1994，1(4):146 －148

［5］ 胡晓峰，刘 斌.家兔肝纤维化模型的建立及CT 灌注成像［J］.医学影像学杂志，2008，18 (1):25 －29

［6］ 马学惠.肝纤维化动物模型的造作方法［J］.中华肝脏病杂志，1996，4(1):58

［7］ Gran D，Wall W，Mimeault R，et al .Successful intestinal transplantation in pigs treated with cyelosperine［J］.Trans Plantation，1988，45(3):279

［8］ Jiang Z，You DY，chen XC，et al.Monitoring of serum markers of fibrosis during ccl4 －induced liver damage－effects of antifibrotic agents［J］.J HePatol，1992，16(3):282 －284

［9］ 韩德五，马学蕙，赵元昌.肝硬化动物模型的研究［J］.山西医药杂志，1979，4(2):12

［10］Blomley MJK，Coulden R，Dawson P，et al.Liver Perfusion studied with ultrafast CT［J］.J ComPut Assit Tomogr，1995，19(3):424－433

［11］ Tsushima Y，Blomley JK，Kusano S，et al The Portal component of hepatic perfusion measured by dynamic CT，an indicator of hepatic parenchymal damage［J］.Dig Dis Sei，1999，44(8):1632 －1638

［12］ Guan S，Zhao WD，Zhou KR，et al.Experimental study of CT Perfusion in hepatitis，hepatic fibrosis and early stage of cirrhosis［J］.Chin J Radiol，2005，39(8):877 －881

［13］Nakashige A，Hotiguehi J，Tamura A，et al.Quantitative measurelnent of hepatic portal perfusion by multideteetor row CT with compensation for respiratory misregistration［J］.Br J Radiol，2004，77(921 ):728 －734

［14］Lautt WW.Mechanism and role of intrinsic regulation of hepatic arterial blood flow:hepatic arterial buffer response［J］.Am J physiol.1985，249(5):549 －556

［15］ Richter S，Muckel I，Menger MD，et al，ImPact of intrinsic blood flow regulation in cirrhosis:m intenance of hepatic arterial buffer response［J］.Am J Physiol，2000，279(2):454 －462

［16］ 史丽静，田建明，毕永民，等.不同对比剂注射流率下多层螺旋CT 肝脏灌注值的比较［J］.中华放射学杂志，2005，39(10):1060 －1063