蟾酥乙醇提取物抗肿瘤剂量效应关系实验研究＊

张飞春，孙文革，高晓玲，石 玫，王延峰，戴建华

(河北省石家庄市中医院，河北 石家庄 050051)

蟾酥的抗肿瘤有效成分多为脂溶性化合物，其中脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基含量较多、活性较强，且具有高效低毒的特点[1]。有研究发现，80%乙醇加热回流提取所得的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基成分的含量最高[2]。为此，笔者采用80%乙醇提取蟾酥，并制备成不同质量浓度的提取物，与SW480细胞共培养，探讨蟾蜍乙醇提取物的最佳抑瘤浓度。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

蟾酥(批号为20100322，石家庄乐仁堂医药公司);华蟾酥毒基对照品(批号为110803－200504)，脂蟾毒配基对照品(批号为110718－200507)，均由中国药品生物制品检定所提供;1640培养基(GIMCO公司);小牛血清(四季青公司);噻唑蓝(MTT)试剂(美国Sigma公司);其他试剂均为分析纯;SW480细胞株(由河北医大四院科研中心赠送)。HT2型酶标仪 (奥地利Anthos公司)。

1.2 方法

1.2.1 蟾酥乙醇提取物制备

取蟾酥10 g，粉碎成细粉，置索氏提取器，加80%乙醇200 mL，加热提取3 h，滤过，滤液蒸干。

1.2.2 薄层色谱分析[3]

取上蟾酥提取物0.2 g，加乙醇10 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，加乙醇1 mL作为供试品溶液。另取蟾酥对照药材0.2 g，加乙醇10 mL，同法制成对照药材溶液。再取脂蟾毒配基及华蟾酥毒基对照品，加乙醇分别制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷 －氯仿 －丙酮(4∶3∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。

1.2.3 蟾酥制剂

已有研究表明，蟾毒配基组合物油水分配系数较大，为典型的疏水性产物，可加入表面活性剂增溶以利于注射剂成型[4]。故应用不同成分的蒸馏水－甘油－吐温－80水包油型乳化剂，对蟾酥乙醇提取物的溶解所需乳化剂比例进行初步试验。

1.2.4 细胞培养与MTT检测

收集对数生长期 SW480细胞，计数后铺96孔板，6×103个细胞 /孔，每孔加含10%胎牛血清的1640培养基至200 μL。将培养板移入CO2孵箱中，在37℃和5%CO2、饱和湿度条件下培养细胞，待细胞贴壁后加药(蟾酥提取物)，药物浓度分别为160，80 ，40 ，20，10 ，5 ，2 ，1 μg/mL，设 5 个副孔，使每孔体积为 300 μL。24 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶充分溶解。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以只加培养液的培养皿为空白对照组。

1.2.5 结果分析

细胞存活率=实验组光吸收值÷对照组光吸收值×100%。应用Microsoft excel软件用细胞存活率对剂量对数作图并按作图法求出半数有效剂量(IC50)值。

2 结果

2.1 蟾酥乙醇提取物性状

取蟾酥10 g，可得到5 g黄棕色粉末状蟾酥提取物。

2.2 薄层色谱分析结果

经薄层色谱分析，在供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同的1个绿色及1个红色斑点(图1)。

2.3 乳化剂成分比例

蟾酥乙醇提取物不溶于水，经过多次调试，以蒸馏水∶甘油∶吐温－80∶药粉=90∶9∶1∶1作为乳化剂，可使蟾酥乙醇提取物完全溶解，制成澄清溶液，有利于抗肿瘤体外试验。

2.4 蟾酥提取物抑制肿瘤的MTT测定结果

结果见表1。

2.5 不同蟾酥提取物质量浓度下细胞存活率及 IC50值

结果见图2。可见，蟾酥乙醇提取物体外抑制肿瘤细胞的IC50=3.488 μg/mL。

图1 蟾酥提取物薄层色谱图

表1 蟾酥提取物抑制肿瘤的MTT测定结果(OD值)

图2 不同蟾酥提取物质量浓度下肿瘤细胞的存活率

3 讨论

已有很多研究表明，蟾酥具有抗肿瘤作用，其抗肿瘤有效成分多为脂溶性化合物。从市售蟾酥中提取抗肿瘤有效成分并进一步研究其抗肿瘤剂量效应关系，涉及蟾酥脂溶性成分提取方法、溶剂选择及肿瘤细胞药物敏感性试验3个方面的问题。本初步研究表明，采用80%乙醇加热回流法可有效提取市售蟾酥中的脂溶性抗肿瘤成分，应用水包油性溶剂可使蟾酥脂溶性提取物较好地溶于溶剂中且有利于肿瘤药物敏感性试验;蟾酥脂溶性抗肿瘤成分抗肿瘤效应呈剂量依赖性，IC50约为3.488 μg/mL。

[1]王 涛，李 芳，姜维刚，等.蟾蜍脂质微球注射液的制备及其灭菌稳定性[J].沈阳药科大学学报，2008，4(25):249－254.

[2]袁旭江，沈嘉茵，朱盛山.不同提取方法对蟾蜍有效成分的影响[J].上海中医药大学学报，2008(5):66－67.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:79－88.

[4]刘 丹，奉建芳.蟾蜍中3种蟾毒配基组合物的表观溶解度和表观油水分配系数的测定[J].中国中药杂志，2008，33(11):1 256－1 258.