兔骨髓间充质干细胞的分离培养及肝内示踪＊

张芙蓉，屠慧渭，钱 波，孙 何，金立方

（绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴 312000）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于多种组织中，骨髓是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源。MSCs具有较强的增殖潜能和多向分化潜能，同时在造血支持和免疫调控等方面也发挥着重要的作用［1－2］。此外，MSCs可以自体取材，体外扩增，具有良好的可塑性也不涉及伦理争议，是组织工程和细胞治疗的理想种源细胞。MSCs在体外可分化为脂肪、成骨、软骨等中胚层的组织细胞，近10年的研究显示MSCs还可跨胚层分化为内胚层的肝样细胞，试验显示移植后的MSCs能改善肝脏疾病动物模型的临床症状［3－8］。若干MSCs肝内移植示踪方法已有应用，如Y染色体探查应用于不同性别间细胞移植［9］，ALU序列应用于不同种属间细胞移植［10］，以及应用cre－Lox方法结合GFP标记细胞显像等放射性同位素标记细胞移植后的肝内分布［11］。这些方法的确立可在不同程度上说明移植细胞的存活和增殖情况，同时为进一步评价骨髓MSCs移植对于肝脏再生和功能恢复的作用提供依据。但这些方法也存在一定的缺陷，如Y染色体只能应用于不同性别间细胞移植的探查，而绿色荧光蛋白（green flurescence protein，GFP）示踪细胞荧光较弱，影响观察效果。携带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green flurescence protein，EGFP）的慢病毒载体转染细胞时不但可整合入宿主细胞染色体内，具有转染稳定、安全无毒等优点，且荧光强度高，可直接观察。兔子是重要的人类肝脏疾病动物模型，本试验将带有EGFP的慢病毒载体感染兔骨髓MSCs，观察其感染效率及细胞活力，示踪其在肝损伤兔受体肝组织内的分布和整合，进一步为MSCs治疗提供理论依据和试验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

健康新西兰大白兔，体重2.5kg左右，年龄5个月～8个月，雌雄不分，来自绍兴文理学院实验动物基地，动物饲养繁殖及试验操作处理符合国际试验动物评估和认证委员会（AAALAC）及绍兴文理学院动物伦理委员会的标志和规定，观察1周后正常的新西兰大白兔用于试验研究。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分离 无菌条件下，对兔剪毛、备皮、碘伏消毒后，利用骨髓穿刺针垂直进针，直至感觉有突破或者落空感，证明针尖已经进入骨髓腔，拔出针芯，利用事先肝素化的10mL无菌注射器回抽，收集一定量的兔股骨骨髓。迅速转移到实验室，无菌条件下，按骨髓液与红细胞裂解液（Tiangen公司）为1∶3的比例加入红细胞裂解液，充分混匀，待红系细胞充分裂解后放入离心机，配平后以1 200 r／min离心5min后弃掉上清。再加入无血清培养基重悬沉淀液，以1 200r／min离心5min后弃掉上清，最后加入含100mL／L FBS（Hyclone公司）的α－MEM培养液（Invitrogen公司）重悬细胞。待接种培养。

1.2.2 MSCs的培养 将上述重悬的细胞以1×105cells／mL的密度接种于铺盖有明胶（Sigma－Aldrich公司）的塑料培养瓶，α－MEM＋10mL／L FBS＋青链双抗（Sigma－Aldrich公司），在37℃、体积分数为5%CO2培养箱（Thermo Forma公司）中培养。倒置显微镜（Nikon ECLIPSE公司）下每天观察细胞生长情况并记录。1d后半换液去除未贴壁细胞的同时并去除未贴壁细胞。待细胞汇合至80%以上时，将培养瓶中培养液吸去，PBS液冲洗两次，用0.5g／L的胰酶（Sigma－Aldrich公司）＋0.1 g／L的EDTA（Sigma－Aldrich公司）的消化液消化3 min～5min，待消化基本完全，轻轻利用移液管收集细胞至离心管，1 200r／min的速度离心5min后弃掉上清，用含100mL／L FBS的α－MEM培养液重悬细胞，细胞计数板计数后，1∶2或者1∶3的比例传代，继续培养。根据细胞生长情况换液。

1.2.3 MSCs的鉴定

1.2.3.1 细胞表面分子CD73和CD105测定 培养至第3代的骨髓间充质干细胞消化后取1×106个细胞，分成4组，40mL／L多聚甲醛固定（Sigma－Aldrich公司）10min～20min，然后分别用带有PE荧光标记的CD73（SH3）（BD Pharmingen公司）和CD105（SH2）（BD Pharmingen公司）抗体孵育30 min，以1 200r／min的速度离心后并用PBS液重新悬浮细胞，流式细胞仪分析（BD Biosciences公司）。

1.2.3.2 细胞分化鉴定

（1）成骨诱导分化及鉴定 取第4代细胞，4孔培养板每孔接种2×104个细胞，待80%～90%融合时换成成骨分化培养基，包括0.1μmol／L的地塞米松（Sigma－Aldrich公司）、50mg／L的维生素C（Sigma－Aldrich 公 司 ）、10mmol／L 的 β－磷 酸 甘 油 钠（Sigma－Aldrich公司）进行联合诱导培养，隔日换液，培养14d和21d后，用钙钴法进行碱性磷酸酶染色，倒置显微镜下进行观察。

（2）成脂诱导分化及鉴定 取第4代细胞，4孔培养板每孔接种2×104个细胞，24h后换成脂肪分化培养基，含100mL／L FBS的 L－DMEM（Invitrogen公 司），0.25μmol／L 地 塞 米 松 （Sigma－Aldrich公司），50μmol／L吲哚美辛（Sigma－Aldrich公司），0.5mmol／L 3－异丁基－1－甲基黄嘌呤（Sigma－Aldrich公司），10mg／L 牛胰 岛素（Sigma－Aldrich公司），每3d换液，诱导2周后，细胞经PBS洗涤，40mL／L多聚甲醛固定30min，进行油红染色检测脂肪沉积，倒置焦显微镜下进行观察。

1.2.4 MSCs的转染 在无抗生素条件下，将携带有EGFP报告基因的慢病毒载体（Invitrogen公司生产，由中国科学院昆明动物研究所惠赠，病毒滴度为4.8×107TU／mL）以不同 MOI值（病毒数／细胞数）添加到培养基中，与MSCs共培养8h，换新鲜培养基，激光共聚焦显微镜（Zeiss，LSM 5105META）下进行观察。

1.2.5 兔急性／亚急性肝功能衰竭模型的建立及MSCs的移植 12只新西兰成年大白兔（雌5只，雄7只），兔耳缘静脉注射D﹣氨基半乳糖2.5mmol／kg，建造急性／亚急性肝功能衰竭模型。24h后耳缘静脉内注射0.1mL MSCS细胞液，浓度为1×108／mL。在移植后第3天（处死2只）、第7天（处死3只）和第15天（处死3只）处死兔子，收集肝组织，5 μm厚冰冻组织切片或HE染色，激光共聚焦显微镜下进行观察。

1.2.6 数据分析 统计数据以平均值±标准误（SEM）进行表示。统计分析采用SPSS 10.0软件进行One－Way ANOVA分析。P＜0.05为差异性显著。

2 结果

2.1 兔MSCs体外的稳定传代

兔MSCs在含有100mL／L胎牛血清的培养基中可在24h内贴壁生长，外观呈梭形（图1A），经过48h的静止期后开始快速增殖，呈螺旋状，倍增时间约为30h，约7d～8d可达80%～90%的汇合（图1 B）。细胞可在体外连续传10代以上，仍具有增殖和分化的潜能。

2.2 兔MSCs表面抗原分析

经免疫细胞化学分析，体外培养的MSCs表达CD105（图2A）和CD73（图2B），符合间充质干细胞的表面抗原特征。

2.3 兔MSCs体外分化能力鉴定

MSCs在脂肪细胞分化培养基中诱导培养后可见细胞质内出现微小、分散的脂滴，2周后脂滴增大并汇合。多聚甲醛固定，油红染色，脂滴可被油红染色（图3A），说明MSCs具备向脂肪细胞分化的潜能。

MSCs在成骨细胞分化培养基诱导培养中培养可见细胞聚集，21d后，多聚甲醛固定，聚集区可被茜素红染色（图3B），说明MSCs具备向骨细胞分化的潜能。

图1 骨髓间充质干细胞的形态（100×）Fig.1 Morphology of BM－MSC（100×）

图2 MSCs表面抗原分析Fig.2 Analysis of surface antigens of MSCs

2.4 兔MSCs的转染结果

慢病毒转染后培育48h后，激光共聚焦显微镜观察转染效率（图4B）。不同感染复数（multiplicit of infection，MOI）对 MSGS转染效率见表1，其中当MOI值等于6时可使81.25%的细胞转染EGFP标记，达到最高的转染效率，且该标记不会随细胞分裂丢失，可稳定表达。

图3 MSCs诱导分化为脂肪细胞（A，200×）和成骨细胞（B，100×）Fig.3 MSCs induced to differentiate into fat cells by oil red staining（A，200×）and into osteoblasts by alizarin red staining（B，100×）

图4 携带有EGFP报告基因的慢病毒载体成功转染MSCs（B），A为B相应的可见光图片，200×Fig.4 MSCs were transected by lentiviral vector with EGFP reporter gene（B）and A is phase contrast microscopy of B，200×

表1 不同的MOI值下的转染效果Table 1 Different MOI values have different transfection efficiency

2.5 MSCs的肝内观察

耳缘静脉注射D﹣氨基半乳糖3d后，处死兔子，肝组织切片HE染色结果显示正常肝组织结构受到破坏，肝组织多个区域肝细胞坏死或凋亡（图5 A，白色箭头所指的区域），部分兔子出现死亡或昏迷等临床现象，表明兔肝组织发生不同程度的急性／亚急性肝衰。通过冰冻切片的观察，可在受体肝组织内发现绿色荧光的细胞。移植的第3天在受体肝组织内可见少量的EGFP标记的供体细胞（图5 B），移植的第7天EGFP标记的细胞数量有所增加（图5C），移植的第15天可见大量的EGFP标记的细胞（图5D）。细胞荧光强度并不随移植的时间延长而减弱。

图5 兔急性／亚急性肝衰竭模型的建立（100×）及供体MSCs在受体肝组织内的分布（200×）Fig.5 Establishment of acute／subacute liver failure of rabbit model and observation of transplanted MSCs in receipt liver

3 讨论

应用成熟肝细胞移植治疗肝脏疾病已有10多年时间，大多数临床病例可以看到症状改善，并维持一年以上，但成熟肝细胞来源有限，很大程度限制了其应用，而以干细胞为来源细胞移植相比成熟肝细胞有许多优势。MSCs是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可分化为具有功能的组织细胞并应用于器官损伤的治疗。近期研究显示，在特定条件下，MSCs可被诱导分化为肝细胞或类肝样细胞。国内外众多学者都已经证实移植的MSCs可定居于肝脏并分化为肝细胞或类肝样细胞，应用骨髓MSCs治疗肝病的临床试验近几年已有少量病例报道，证实骨髓MSCs分化来源的肝细胞移植可以降低死亡率，改善肝功能［3－8］。

若干体内移植细胞示踪方法已有应用，如Y染色体探查应用于不同性别间细胞移植，ALU序列探查和荧光原位杂交技术（FISH）应用于不同种属间移植、放射性同位素标记移植细胞以及应用GFP标记细胞显像。这些方法的确立可在不同程度上说明移植细胞的存活和增殖情况，但均存在不同程度的缺陷。Y染色体探查及ALU序列探查因其自身的特点而无法广泛使用［9－14］。与其他病毒载体系统相比，慢病毒具有能够转染分裂和非分裂的细胞并稳定表达治疗基因，无明显免疫反应等特点，同时能偶转染广泛的组织、能够被浓缩成高滴度等优点。EGFP作为报告基因具有观察简单方便和直观的优点，EGFP在470nm波长处可吸收激发光，在510 nm发射绿色荧光，只要有足够的表达，可以直接在冰冻的组织切片下观察，甚至直接在活体状态下观察，克服了传统GFP方法及其他报告基因需要底物及维持时间短的缺点［15］。本研究结果表明EGFP标记的细胞在受体肝组织内呈一定的分布，在不使用GFP抗体的情况下可在冰冻组织切片里直接观察，是一种简单高效的示踪细胞的方法。

本研究利用携带EGFP报告基因的慢病毒载体转染兔骨髓来源MSCs，转染后的兔骨髓MSCs的生长状态、增殖与转染前基本一致，说明慢病毒载体携带EGFP转染在一定范围内不影响兔骨髓MSCs的生长特性，这与已有的文献报道基本一致［16－17］。试验结果还显示慢病毒转染效果与转染MOI值相关，在一定范围内转染效率随MOI值的增大而提高，但超过一定值后，转染的阳性率反而出现下降。原因可能是使用过高的MOI值（即提高病毒浓度）导致病毒的细胞毒性致使细胞死亡，致使转染效率降低。

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