抗菌肽CecropinAD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

江学斌 张敏静 林健聪 梁世中

抗菌肽（antibacterial peptide）是一类在一定诱导条件下，由宿主细胞特定编码基因产生的对抗外源性病原微生物的小分子肽类活性物质。经研究表明，抗菌肽具有分子量小、稳定性好、无免疫原性等特点，具有广谱的抗菌、抗病毒作用，在生物体的自然免疫中具有重要的防御和保护作用。天蚕素 (Cecropins)是由Boman等[1]从惜古比天蚕蛹中诱导分离获得，由37～39个氨基酸组成，相对分子质量约4000 Da，包括Cecropin A、Cecropin B、Cecropin C、Cecropin D 等，是目前研究背景最为清晰、作用效果较好的一类抗菌肽。而抗菌肽Cecropin AD（CAD）是由cecropin A的N端1～11肽段和cecropin D的C端12～37肽段组成的杂合肽，呈线性阳离子α螺旋构型，其杀菌活性和抗菌谱明显优于cecropin A和cecropin D[2]，具有无残留毒性和病原体难以产生耐药性的优点，应用前景广阔。

抗菌肽被认为是目前最有发展前景的天然多肽抗生素和绿色饲料添加剂。与传统抗生素相比，抗菌肽不仅具有广谱的抗菌活性，稳定性高，而且不易导致耐药性菌株产生[3]。而抗生素作为饲料添加剂使用容易破坏动物胃肠道微生物平衡，在动物体内残留，严重影响产品质量；同时，滥用抗生素易产生多耐药性菌株，从而导致难以控制的大面积动物疫情。多项实验结果表明，抗菌肽可提高动物抗病能力，促进动物生长[4－7]，而且不容易产生耐药性，具有替代传统饲用抗生素的潜能。然而，由于抗菌肽在生物体内含量极少，难以大量提取获得；而其分子量小，对表达宿主具有抑制和杀伤作用，因此，抗菌肽的规模化生产仍是目前限制抗菌肽应用的首要瓶颈。

本研究采用基因工程技术，在毕赤酵母中通过组成型分泌到胞外的方式表达抗菌肽Cecropin AD，并进行抗菌肽Cecropin AD组成型表达的50 L发酵罐规模中试研究，研究其体外抗菌活性和抗菌谱，为抗菌肽的规模化生产和应用提供前期基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

酵母表达菌株Pichia pastoris X－33、含抗菌肽CAD基因片段的质粒pUC－CAD、真核表达质粒pGAPZα－A、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌 ATCC25923、金黄色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草杆菌、绿脓杆菌ATCC27853等均由广州大学生物工程研究所保存。

1.1.2 工具酶和试剂

限制性内切酶Xba I、Xho I和Sca I，质粒小量提取试剂盒、T4DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、DNA聚合酶、Zeocin等购自中国大连宝生物工程有限公司；PCR引物由广州英潍捷基公司生物技术有限公司合成。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组表达载体的构建

根据抗菌肽CAD基因序列，设计并合成两条上下游特异性引物（见表1）。以pUC－CAD为模板，利用PCR扩增的方法获得编码抗菌肽CAD的DNA片段，该片段的两端分别含有Xho I和Xba I酶切位点。PCR扩增得到的基因片段经限制性内切酶双酶切后连接到pGAPZα－A上，构建表达质粒pGAPZαA－CAD并转化大肠杆菌DH5α，Zeocin抗性筛选重组转化子并送广州英潍捷基公司生物技术有限公司进行DNA序列测定。

表1 扩增目的基因PCR引物

1.2.2 重组质粒对酵母宿主菌X33的转化

制备毕赤酵母菌株X33的感受态细胞，取80 μl与10 μg Avr II单酶切线性化的重组表达质粒pGAPZα－A－CAD混匀，进行电击转化（25 μF，1500 V），29 ℃温育1 h后，将菌液涂在含有100 μg/ml Zeocin抗生素的YPD固体培养基平板上，29℃恒温培养2～4 d，筛选出阳性菌落。同时，将Avr II线性化的pGAPZα－A空质粒转化酵母，制备的pGAPZα－A转化X33菌株作为空白对照。挑取平板上的转化子，振荡培养过夜，离心收集菌体进行PCR鉴定，以X33/pGAPZα－A培养上清为阴性对照，筛选出整合有目的基因的重组子。

1.2.3 重组抗菌肽Cecropin AD的表达

将PCR鉴定得到的阳性重组酵母转化子X33/pGAPZαA－CAD分别接种到10 ml YPD培养基中29℃，250 r/min振荡培养96 h后，离心收集培养上清。以 X33/pGAPZα－A 培养上清为对照，Tricine－SDSPAGE检测培养上清中重组蛋白的分泌表达情况。

1.2.4 重组抗菌肽Cecropin AD的初步抗菌活性测定

采用琼脂孔穴扩散法，以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为实验菌株，将金黄色葡萄球菌悬浮液（OD600=0.5～0.6）50 μl与 46 ℃的 LB 固体培养基 100 ml混匀后铺平板，待其凝固后4℃保存，用无菌打孔器（直径8 mm）打孔，每孔中滴加经100℃加热处理10 min的待测培养上清100 μl，待孔中液体被培养基吸收完全后，上述平板37℃倒置培养过夜（10～12 h）。以同体积的X33/pGAPZα－A培养上清为阴性对照，氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）为阳性对照，第2 d测量抑菌直径，抑菌圈直径(mm)=测量直径－孔径(即8 mm)。

1.2.5 抗菌肽Cecropin AD的中试发酵

一级种子：上述筛选得到的抗菌活性最强的重组菌株甘油菌种，取0.5 ml接入含YPD培养基20 ml的100 ml锥形瓶中，29℃、250 r/min培养10 h；二级种子：按5%的接种量接入含YPD培养基250 ml的1 L锥形瓶中，同样条件下培养10 h；三级种子：按10%的接种量接入含有YPD培养基3 L的5 L发酵罐，同样条件下培养约10 h。

50 L罐发酵：培养在50 L发酵罐中进行，发酵罐基础培养基为30 L的YPD培养基，接种前校正pH值电极和溶氧电极，培养过程中保持通气量大于60 L/min，发酵过程中菌体利用葡萄糖产酸，用KOH溶液调节pH值5.5，培养温度设定为29.0℃，起始转速为150 r/min，随着菌体的生长不断提高转速，发酵过程中控制溶氧大于30%，培养48 h后放罐。每2 h取少量发酵液，测定其菌体湿重、葡萄糖含量以及抑菌活性。转速、温度、pH值和溶氧等参数由发酵罐自动检测，记录数据。

1.2.6 抗菌肽Cecropin AD的中试发酵产物抗菌活性测定

参照1.2.4节的方法，以同体积的X33/pGAPZα－A培养上清为阴性对照，氨苄青霉素为阳性对照，测定抗菌肽Cecropin AD的中试发酵产物对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌 DH5α、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草杆菌、绿脓杆菌ATCC27853的抗菌活性。

2 结果

2.1 重组克隆载体的构建与鉴定

以pUC－CAD为模板，利用上下游特异性引物F和R，通过PCR方法获得编码抗菌肽CAD蛋白的DNA片段。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，在120 bps附近得到目的条带，与预期大小相符（见图1）。PCR扩增得到的基因片段经限制性内切酶（Xho I和Xba I）双酶切后连接到pGAPZα－A上，转化大肠杆菌DH5α，Zeocin抗性筛选重组转化子并送广州英潍捷基公司生物技术有限公司进行DNA序列测定，测序结果显示，所得到编码重组蛋白CAD的DNA序列与预期一致（资料未显示）。

挑取抗性平板上的转化子，29℃、250 r/min，振荡培养过夜，离心收集菌体进行PCR鉴定，结果见图2，所挑取重组子均呈PCR阳性。

图1 PCR扩增产物

图2 PCR筛选重组酵母

2.2 重组抗菌肽Cecropin AD的表达和初步活性测定

挑取上述PCR鉴定呈阳性的重组转化子分别接种到10 ml YPD培养基中29℃，250 r/min振荡培养96 h后，离心收集上清。培养上清的Tricine－SDS－PAGE检测结果表明，与X33/pGAPZα－A培养上清相比，重组子培养上清在4.0kDa处均有一明显的蛋白条带 (见图3)，与抗菌肽Cecropin AD的理论分子一致。琼脂孔穴扩散法测定重组子抗菌活性结果也显示 (见图4)，经加热处理的重组子培养上清对金黄色葡萄球菌ATCC25923具有显著抑制作用，而同样处理的对照菌株X33/pGAPZα－A的培养上清则未见明显抑菌圈。

2.3 重组抗菌肽Cecropin AD的中试发酵

经Tricine－SDS－PAGE和琼脂孔穴扩散法筛选得到工程菌X－33/pGAPZαA－CAD，通过种子活化和三级种子扩增后，转入50 L发酵罐进行中试发酵研究。如图5所示，工程菌Pichia pastoris X－33/pGAPZαA－CAD接种后 0～8 h，菌体湿重（wet weight）缓慢增加，处于适应期，8 h后，菌体开始快速生长进入指数生长期，利用葡萄糖产酸导致pH值下降，缓慢流加KOH维持pH值在5.5左右。至发酵12 h时，发酵液开始检测到抗菌活性，随着发酵时间的延长，抗菌活性增强，42 h后，抗菌肽CAD的表达开始进入平台期，抗菌活性增长缓慢，至48 h，抗菌活性达到最大，停止发酵，收获培养上清。

图3 重组抗菌肽Cecropin AD表达产物的Tricine－SDS－PAGE 分析

图4 重组抗菌肽Cecropin AD表达产物的抗菌活性测定

琼脂孔穴扩散法试验结果也显示 (见图6)，36和48 h发酵液上清经100℃加热处理10 min后对金黄色葡萄球菌ATCC25923均有明显的抑杀作用；但100 μl培养48 h的发酵液上清对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌圈直径(减去孔径8 mm)可达17.8 mm，抑菌活性明显优于2 μg的阳性对照Amp(11.5 mm)。

图5 Pichia pastoris X－33/pGAPZαA－CAD 发酵的菌重与抑菌活性的变化

图6 重组抗菌肽Cecropin AD发酵液的抑菌活性

2.4 重组抗菌肽Cecropin AD中试发酵产物的抗菌活性检测

50L发酵收获的上清，经100℃加热处理10 min后，分别取100 μl检测发酵上清对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌 ATCC25923、金黄色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草杆菌、绿脓杆菌的抗菌活性，结果见表2，重组抗菌肽Cecropin AD发酵上清对供试菌的敏感程度依次为：枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠杆菌 ATCC 25922＞大肠杆菌DH5α、耐药性金黄色葡萄球菌 MRSA 5636＞绿脓杆菌ATCC27853。

3 讨论

近年来，滥用抗生素导致耐药细菌产生的问题不断加剧，超级细菌的出现更使人们重新审视抗生素的定位和作用。越来越多的国家对抗生素在农产品中的添加予以限制和禁止，因此，迫切需要开发能够取代传统抗生素的新型添加剂。抗菌肽具有热稳定性好、抗菌谱广、杀菌快、无耐药性及毒副作用等特点，并且与传统抗生素共同使用有增效作用，已成为人们关注的热点。在农业养殖方面试验结果显示，抗菌肽作为饲料添加剂，在肉鸡、乳猪和对虾方面已经获得了很好的成效[5-7]，不仅可以抗病，还可以增强动物机体的免疫力，提高肉料比，均显示了抗菌肽具有替代传统抗生素的潜能。

表2 重组抗菌肽Cecropin AD中试发酵产物的抗菌谱

随着抗生素在农产品生产中的限制和禁止，必将导致行业对抗菌肽的需求不断上涨，但从生物体中提取抗菌肽的含量太少，难度大，而化学合成成本高等限制因素，已成为抗菌肽开发应用的一个瓶颈。而通过基因工程技术生产抗菌肽则具有成本低廉、产量大的优点，有望实现抗菌肽的规模化生产。毕赤酵母表达系统是优秀的真核表达系统，已有多种外源蛋白在酵母表达系统中成功表达并得以应用[8-10]。它具有完备的基因表达调控机制、蛋白质加工修饰[11]及分泌能力，而且不会产生内毒素。本研究基于抗菌肽CecropinAD稳定性良好的前提，通过毕赤酵母表达系统组成型表达抗菌肽Cecropin AD，通过信号肽将其分泌到细胞外，并进行了50 L发酵罐的中试研究，此方法获得的抗菌肽作为饲料添加剂，方便快捷，不会因内毒素而导致动物机体中毒和腹泻，同时，组成型区别于甲醇诱导型的酵母表达方式，培养简单，无需更换碳源，也可以避免挥发性的毒性物质甲醇污染动物机体和环境。

4 结语

本试验对重组抗菌肽CecropinAD进行了50 L规模的发酵中试研究，结果表明，菌体湿重到了后期增长缓慢，其主要原因是抗菌肽在组成型表达的过程中，随着Cecropin AD浓度不断上升，其表现出对酵母宿主菌的毒性作用，当表达的抗菌肽CecropinAD达到了一定的浓度后，宿主菌停止生长，抗菌肽表达进入平台期后结束发酵。该发酵周期短，培养简单方便，节省成本。后期工作重心在于提高抗菌肽Cecropin AD基因工程菌的生物量及其表达量，优化发酵培养基的碳氮源配置，更大程度地降低生产成本，为日后的规模化生产和应用打下坚实的基础。

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