橡胶树白粉病杀菌剂生物测定接种方法研究

杨意伯, 谭志琼, 郑服丛, 张荣意

(海南大学环境与植物保护学院,儋州 571737)

橡胶树粉孢(Oid iuMheveae Steinm.)危害橡胶树嫩叶、嫩梢及花序,造成落叶、枝枯、果实失收,严重威胁我国橡胶产量[1]。目前在防治上仍以化学防治为主,由于病原菌为专性寄生菌,杀菌剂防效测定只能在活体上进行,因此接种方法和接种量关系到试验结果的准确性和可比性。国内外对橡胶树白粉病菌接种方法均无具体描述,亦未明确接种量[2-3]。作者参考前人对其他作物白粉病菌生物测定技术的研究[4-7],对抖粉法、涂抹法和喷雾法等3种接种方法进行比较,并测定了喷雾法的适宜接种量,旨在进行橡胶树白粉病杀菌剂室内盆栽毒力测定。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

橡胶树粉孢(Oid iuMheveae)采自海南省儋州那大地区,将野外自然发病的橡胶树叶带回实验室,采用单斑分离法得到纯菌株。轻轻弹去病叶表面的分生孢子后培养1 d,使病原菌长出新鲜分生孢子。

1.2 供试植物

半年生橡胶树芽接幼苗,品系为‘热研 7-33-97’,塑料棚隔离种植。待幼苗长出宽度为2～3 cm的健康古铜色嫩叶后,将生长状态较一致的幼苗移入室内备用。

1.3 供试药剂

吐温20(分析纯)由国药集团化学试剂有限公司生产,15%三唑酮可湿性粉剂由上海升联化工有限公司生产。

1.4 比较不同接种方法对寄主发病程度的影响

1.4.1 抖粉法

剪下2片表面布满新鲜病斑的病叶,叶面朝向健康幼苗,手指轻弹叶背使分生孢子飞出,重复3次,每重复接种1株,对照不接种。将幼苗置于18～25℃,相对湿度70%～80%室内培养,光照12 h/d。接种后第8～11天调查病情,计算变异系数[8]。

叶片病情分级标准：对《橡胶树白粉病测报技术规程》的分级标准进行了修改,使之更适合本研究实际情况(表1)。

表1 橡胶树白粉病叶片病情分级标准

1.4.2 涂抹法

用直径0.3 cm的玻璃棒蘸取新鲜分生孢子接种于健康嫩叶上,重复3次,每重复接种1株,对照不接种。室内条件同1.4.1,计算变异系数。

1.4.3 喷雾法

用毛笔将新鲜分生孢子刷入0.05%吐温20水溶液,混合均匀后用血球计数板在10×10倍显微镜下镜检,调整孢子浓度为10×104个/ML。用小型喷雾器将孢子悬浮液喷洒在健康嫩叶上,使雾滴布满叶面但不滴落,重复3次,每重复接种1株,对照不接种。室内条件同1.4.2,计算变异系数。

1.5 抖粉法与喷雾法测定三唑酮EC50的稳定性

抖粉法：用蒸馏水将15%三唑酮可湿性粉剂配制成系列浓度,分别装入小型喷雾器喷施橡胶幼苗,对照喷施蒸馏水,每处理接种1株,重复3次。喷药时,使雾滴布满叶面但不滴落。喷药后1 d采用抖粉法接种。室内条件同1.4.1,计算相对防效[10]。药液浓度以对数表示,为x值;查表将防治效果换算成几率值,为y值,以此计算毒力回归方程y=a+b x、EC50和相关系数[10]。该试验重复做3次,分别得到3个EC50值,计算变异系数。

喷雾法：药剂配制方法同抖粉法。对照喷施蒸馏水,每处理接种1株,重复3次。喷药后1 d将浓度为10×104个/ML的孢子悬浮液喷雾接种。室内条件同1.4.1,计算相对防效、毒力回归方程、EC50和相关系数。该试验重复做 3次,分别得到 3个EC50值,计算变异系数。

1.6 喷雾法接种量对病情指数的影响

用毛笔将新鲜分生孢子刷入0.05%吐温20水溶液,混合均匀后用血球计数板在10×10倍显微镜下镜检,将孢子浓度调整为 16×104、14.5×104、13.3×104、12 ×104、10 ×104、9 ×104、8 ×104、7 ×104、6 ×104、5×104、4×104、3 ×104、2×104、1 ×104个/ML。用小型喷雾器将各浓度孢子悬浮液喷雾接种健康幼苗,每处理接种1株,重复3次。室内条件同1.4.1,接种后第8～11天调查病情。

1.7 喷雾法接种量对防效测定结果的影响

药剂配制方法同抖粉法。对照喷施蒸馏水。喷药1 d后,配制不同浓度的分生孢子悬浮液(同1.6)并喷雾接种施过药的幼苗,每处理接种1株,重复3次。室内条件同1.4.1,调查病情,计算相对防效。

2 结果与分析

2.1 不同接种方法寄主发病程度比较

若以病株为调查对象,抖粉法、涂抹法、喷雾法这3种接种方法都能使寄主发病,发病率皆为100%;若以叶片为调查对象,这3种方法的发病轻重程度则有相当大的差异(图1)。采用涂抹法接种,有的叶片发病轻微,有的叶片病斑面积超过叶面积一半;抖粉法接种的大多数叶片发病严重,病斑之间连成一片,覆盖整个叶面;喷雾法接种的叶片也有很多病斑,但发病严重程度稍低于抖粉法。从病斑在病叶上的分布情况看,涂抹法和抖粉法都存在大量病斑集中在叶片一侧而另一侧病斑很少的问题,即接种不均匀;而喷雾法的病叶无论发病轻重,病斑都能均匀分布于叶面。

不同接种方法在叶片发病率与发病严重度上的差异可用病情指数来量化。如表2所示,涂抹法接种的病情指数最高为85.7,最低为32.6,相差近3倍;变异系数最高,达到44.5%,分别为抖粉法和喷雾法的4倍和7倍,可见涂抹法重复性最差,而且每片叶都要人工涂抹,操作繁琐,因此不适合作为药效测定的接种方法。抖粉法和喷雾法都能使寄主严重发病,重复间病情指数范围都在80～100,平均值相同,前者的标准差和变异系数都较高,但与后者无显著差异,说明采用这两种方法接种的病情指数比较稳定。

图1 不同接种方法对橡胶树叶片发病严重度的影响

表2 不同接种方法对橡胶白粉病病情指数的影响1)

2.2 抖粉法与喷雾法测定三唑酮EC50的稳定性

试验结果见表3。喷雾法接种重复间EC50值分别为 5.2、8.4、9.8mg/L,变异系数为30.6%,远低于抖粉法的53.3%,说明喷雾法接种测定的EC50值重复间变化较小,稳定性较好;抖粉法接种测定的EC50值波动较大,且毒力回归方程的相关系数较低,说明相关性较差。不同重复之间即使用相同浓度的药剂处理,防治效果也存在较大差异(表4),这和前人观察到的现象一致[5]。

表3 抖粉法和喷雾法接种测定15%三唑酮WP的EC50

2.3 喷雾法接种量对病情指数的影响

在接种量(1～16)×104个/ML范围内,病情指数随着接种量的增加而递增(图2);当接种量小于6×104个/ML时,病指增加较快,超过 6×104个/ML后,病指达到90以上,随着接种量的增加而缓慢上升,各处理间无显著差异;接种量达(8～16)×104个/ML的病情指数均接近100,增长趋向停止,增长曲线呈水平状。

表4 抖粉法和喷雾法接种同浓度不同重复间三唑酮的防效比较

图2 接种量对橡胶白粉病病情指数的影响

2.4 喷雾法接种量对防效测定结果的影响

10mg/L三唑酮对病原菌的防治效果随着接种量的变化而变化(图3);接种量增大,防治效果渐趋下降,最低和最高接种量相差16倍,防效相差2倍以上。从图中可看出,防治效果的变化有3个较稳定的阶段：接种量大小范围分别为(1～4)×104个/ML、(5～10)×104个/ML、(12～ 16)×104个/ML时,范围内各处理的防治效果无显著差异。接种量(1～4)×104个/ML的对照病情指数大多在65～75(图2),药剂处理后的几个重复发病程度变化大,导致防效平均值的标准差很高(图3),不能真实反映药剂的抑菌活性。接种量(5～10)×104个/ML的对照病情指数达90以上,防治效果72.2%～63.4%,处理间的防效差异不显著,标准差也相近;接种量 12×104个/ML与 10×104个/ML的防效差异较显著,随着接种量继续增大,防治效果则下降较快,(12～16)×104个/ML的对照病情指数接近100,但防效为56.9%～40.6%,处理间的降幅较大。综上所述,接种量控制在(5～10)×104个/ML,防效测定结果较稳定。

图3 病菌接种量对10mg/L三唑酮防效测定的影响

3 讨论与结论

其他作物白粉菌的接种方法中,马严明[4]和朱振家[7]将分生孢子吹至叶面接种,贾忠明[6]使用毛笔蘸取孢子粉或孢子悬浮液接种,李兴红[11]等采用孢子悬浮液喷雾接种。由于不同实验室的条件不同,如选用的品种、寄主栽培条件及发病培养条件的差异,最适接种量都可能有所不同,因此在测定前首先要确定接种方法和接种量[4]。

S.Liyanage[12]等的研究结果表明,喷射微水滴显然不影响分生孢子萌发,只有在分生孢子与自由水接触一段时间或有大水滴时水才是有害的。因此喷雾法能使寄主发病均匀,便于检查结果和统计分析;缺点是在具体操作中能否喷施均匀取决于试验人员是否有经验和掌握技巧。在接种前试喷几次,增加熟练程度,以雾滴布满叶面但不滴落为宜,可避免接种不均。

接种量过低和过高都难以真实反映药剂的抑菌活性[4]。本试验发现接种量对橡胶树白粉病药剂防效测定结果有一定影响,与马严明对小麦白粉病菌的研究结果类似[4]。但前人试验结果的变化较显著,接种量相差3倍,EC50值相差达9倍,这可能与前人采用的试验材料为2.5～3 cm的离体叶段以及可精细控制的环境条件有关。前人测定的是EC50值,而作者为了缩短时间,改以10 mg/L三唑酮的相对防效作为指标,是否能真实反映接种量对生测结果的影响,有待进一步研究。在实际操作中,为了使对照病情指数变化不太大,作者每次配制分生孢子悬浮液时都将浓度调整为(8～10)×104个/ML。

综上所述,在进行杀菌剂对橡胶树白粉病菌的室内盆栽毒力测定时,应使用分生孢子悬浮液喷雾接种,接种量以5×104～10×104个/ML为宜。

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