新疆低温稠油油藏厌氧硝酸盐还原菌与硫酸盐还原菌富集产物菌群分析

马莎莎，张 凡，舒福昌，侯读杰，佘跃惠

(1.长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州 434023；2中国地质大学(北京)能源学院，北京 100080)

硝酸盐还原菌(Nitrate reducing bacteria，NRB)和硫酸盐还原菌(Sulfate reducing bacteria，SRB)是油田普遍存在的两类微生物菌群。原油的酸化和管道的腐蚀主要是由SRB还原硫酸盐产生H2S所导致的[1，2]。抑制SRB的活性、减少H2S的产生是油田生产的一项十分重要的工作。除了化学杀菌处理外，目前最为环保的抑制SRB活性的方法是生物竞争排除技术(Biocompetitive exclusion)[3]，该技术是利用硝酸盐还原菌、亚硝酸盐还原菌以及反硝化微生物阻止SRB获得所需营养物而抑制其产H2S的活性[4]。目前，大多研究仅针对单个菌株对H2S产生的影响，但油田微生物菌群较为复杂，菌群之间相互影响，因此，对微生物菌群进行全面的认识对生物竞争技术研究是很有必要的。随着分子生物学和系统发育分析方法的发展，基于16S rRNA(rDNA)的分子生物学方法被用来分析复杂的生态系统，特别是构建16S rDNA PCR扩增片段克隆文库来分析微生物菌群组成[5]。

作者在此直接采集油井井口样品接种于NRB和SRB富集培养基中培养，通过克隆文库分析富集培养物中的微生物菌群，以期为油田开发NRB抑制硫酸盐还原作用新技术提供理论依据。

1 实验

1.1 样品

样品采自新疆克拉玛依油田六中区克下组油井T6191井口，该油层含油面积10.3 km2、地质储量2.084×107t，属克拉玛依Ⅲ类砾岩油藏。该油井产出液平均含水量2.1%，原油相对密度0.899，地层原油粘度80 mPa·s，凝固点-49℃，含蜡量3%，含胶量58%，属于低温轻质稠油油藏。井口油水样品被直接装入无菌瓶，在进行分子实验前于4℃保存。

1.2 NRB和SRB富集培养

在基础培养基中加入不同的碳源和能源用来富集NRB和SRB菌群。

基础培养基(1 L)：10 g NaCl，3 g MgCl2·6H2O，0.15 g CaCl2·2H2O，0.25 g KCl，0.6 g KBr，0.5 g KH2PO4，pH值7.0。

NRB富集培养基：1 L基础培养基中加入3 g KNO3，1 g乙酸钠，1 g酵母膏，1 mL刃天青母液 (1%)，pH值7.0。

SRB富集培养基：1 L基础培养基中加入 4 g Na2SO4，1 g乙酸钠，1 g酵母膏，1 mL刃天青母液 (1%)，pH值7.0。

所有培养基被分装入250 mL厌氧瓶中通入N2，高压湿热灭菌后，按30 mL·L-1加入1 mol·L-1NaHCO3、按1 mL·L-1加入微量元素母液和维生素母液[6]。培养基中接种2% (体积分数)产出水和5%(质量浓度)原油，按地层温度25℃培养120 d。

1.3 NRB和SRB富集培养物中DNA的提取

1.3.1 富集产物DNA的提取

吸取2 mL富集培养液，于12 000 r·min-1离心10 min收集菌体细胞。根据FastDNA Spin Kit for Soil (Qbiogen，Carlsbad，CA.U.S.A)试剂盒说明提取基因组DNA。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.3.2 16S rRNA基因全长扩增

使用16S rDNA片段扩增通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，从基因组总DNA中扩增16S rDNA片段。PCR扩增体系及程序参照文献[7]。

1.4 克隆文库的建立

用琼脂糖凝胶回收试剂盒[Agarose Gel DNA Purification Kit (TianGen Biotech，Beijing，China)]对16S rDNA扩增产物进行割胶、纯化。然后将回收产物16S rDNA片段pGEM T-easy克隆载体(Promega)，通过化学法转化到感受态细胞Trans1-T1 competent cells (TransGen Biotech，Beijing，China)中。从2个文库各挑取100个白斑克隆，以少量菌体作为模板通过载体通用引物T7/SP6扩增来检测阳性克隆。PCR产物先用限制性内切酶HaeⅢ 和HhaⅠ进行酶切，再用2%琼脂糖凝胶电泳分析限制性片段，最后对电泳图谱进行限制性酶切片段长度多态性(ARDRA)分析[8]。将酶切图谱相同的克隆归为一个发育类型(OTU)。

1.5 克隆文库库容

应用Rarefaction分析软件(http://www.uga.edu/strata/software/software.html)对克隆文库的库容饱和度进行分析，以检测建立的克隆文库是否已经足够全面地代表NRB和SRB菌群的多样性。

1.6 测序和构建系统发育树

挑取ARDRA分型归为一类的代表性克隆接种于含有100 μg·mL-1氨苄的液体LB培养基中，37℃培养20 h后送测序公司(SinoGenoMax Co.，Ltd.，Beijing，China)测序。所得序列通过DNAMAN软件进行处理，并在NCBI(National Center for Biotechnology，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)数据库中比对分析，寻找亲缘关系最近的序列用DNAMAN软件构建系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 NRB和SRB微生物菌群分析

在NRB和SRB的16S rRNA基因克隆文库DGS1和DGS2中各选择100个阳性克隆子，通过HaeⅢ和HhaⅠ双酶切分型分为了11和12个OTU。Rarefaction分析曲线(图1)显示，当阳性克隆子达到90个时曲线趋于水平，说明克隆文库能够反映样品微生物菌群结构。

图1 克隆文库DGS1和DGS2的Rarefaction分析曲线

16S rRNA基因克隆文库NRB和SRB的系统发育树见图2。

各分支后的数字代表该系统发育类型在克隆文库中所占的比例

由图2可知，克隆文库NRB中优势菌群为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)(35%)、未培养拟杆菌(UnculturedBacteroidetesbacterium)(37%)、螺旋体(Spirochaeta)(9%)和产氨基酸杆菌(Acidaminobacterhydrogenoformans)(9%)。克隆文库SRB中优势菌群为脱硫弧菌(Desulfovibriocaledoniensis)(43%)、未培养拟杆菌(20%)、脱硫单胞菌(Desulfuromonasmichiganensis)(12%)和螺旋体(8%)。将所得序列在NCBI数据库中对比分析，结果表明，大多数序列(>90%)和GenBank中已有的16S rDNA序列同源性大于97%，说明该富集培养物中微生物的可培养性。虽然NRB和SRB菌群为两种不同培养基的富集产物(图3)，其优势菌群不同，但是未培养拟杆菌和螺旋体在2个文库中均出现了，说明这两种菌能在两种培养基中生长。特别是未培养拟杆菌在2个文库中都为优势菌。

图3 硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌富集培养物中菌群分布关系

2.2 讨论

NRB和SRB富集产物微生物菌群结构存在差异。NRB富集培养物中施氏假单胞菌占35%，它是油田常见菌群，能将硝酸盐还原成氮并且能代谢多种有机物[9]；SRB富集培养物中脱硫弧菌、脱硫单胞菌、梭状芽孢杆菌(Clostridiabacterium)都是典型的硫酸盐还原菌，大约覆盖了文库的60%。由此可知富集培养产物为目的产物。

NRB和SRB富集产物微生物菌群虽然存在差异，但是未培养拟杆菌和螺旋体在2个文库中都出现，特别是未培养拟杆菌在2个文库中均为优势菌，这可能是由于在富集培养基中加入了原油，而拟杆菌和螺旋体是一类能以烃为碳源的菌群[10，11]。因此在两个加有原油的富集培养基中出现这类以烃为碳源的菌群并且形成一定优势。因为原油储层中不可避免地存在原油，为了能更好地模拟储层环境，在富集培养基中加入原油是有必要的。

SRB富集产物中出现了一定量的硫磺单胞菌属(Sulfurospirillum)，这类菌的出现可能是由于培养基中硫化物含量增加所致，同时它们也是油田生物竞争排除技术的目的菌群，是后续研究工作的重点所在。

3 结论

基于16S rDNA分子克隆文库方法，分析新疆克拉玛依油田六中区采油井T6191井口样品硝酸盐还原菌(NRB)和硫酸盐还原菌(SRB)富集产物的菌群多样性。16S rRNA基因克隆建库结果表明，NRB和SRB菌群存在明显的差异，其优势菌不同，前者主要为降烃菌，后者则与硫酸盐还原作用密切相关；NRB和SRB菌群中同时存在未培养拟杆菌和螺旋体，这与原油储层环境有关，它们均能降解石油烃，菌群分析结果为油田开发NRB抑制硫酸盐还原作用新技术提供了理论依据。

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