HPLC法测定盐酸左布比卡因有关物质及对映体纯度

符义刚，李莉娥，李 杰，胡先明

(1.武汉大学药学院，湖北 武汉 430072；2.宜昌人福药业有限责任公司，湖北 宜昌 443005)

手性药物由于其对映异构体之间可能具有不同的药效学和药动学性质，近年来引起广泛的关注。如酰胺类局部麻醉药布比卡因，其右旋异构体的心肌抑制作用强，但其左旋异构体由于具有较低的神经和心血管毒性而应用于临床。因此，为了保证盐酸左布比卡因(Levobupivacaine hydrochloride)临床应用中安全有效，必须对有关物质及右旋异构体进行控制[1，2]。为了有效地控制盐酸左布比卡因的含量，作者参照文献[3]，对HPLC色谱条件和方法进行优化，建立了盐酸左布比卡因有关物质测定以及对映体纯度测定的高效液相色谱方法。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

盐酸左布比卡因样品(批号：100601、100701、100801)、盐酸左布比卡因对照品(批号：100601R)，宜昌人福药业有限责任公司；盐酸布比卡因对照品(批号：H2H088)，USP；2，6-二甲基苯胺(批号：S36420-224)，Merck-Schuchardt公司。实验用水为娃哈哈纯净水；甲醇、乙腈，色谱纯；其它试剂均为分析纯。

Waters e2695型高效液相色谱仪，Waters 2489紫外检测器，Epower 2色谱工作站(美国Waters)。

1.2 方法

1.2.1 盐酸左布比卡因有关物质测定

1.2.1.1 色谱条件

Dikma Platisil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为磷酸盐缓冲溶液(取1 mol·L-1磷酸二氢钠1.3 mL、0.5 mol·L-1磷酸氢二钠32.5 mL，加水至1000 mL使溶解，调节pH值为8.0)-乙腈(40∶60，体积比)；检测波长240 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL。

1.2.1.2 溶液的制备

(1)供试品溶液

取盐酸左布比卡因样品适量，加流动相溶解并稀释，得到2 mg·mL-1的供试品溶液。

(2)对照溶液

取盐酸左布比卡因对照品适量，加流动相溶解并稀释，得到0.02 mg·mL-1的对照溶液。

(3)2，6-二甲基苯胺对照溶液

取2，6-二甲基苯胺适量，加甲醇溶解并稀释，得到0.2 mg·mL-12，6-二甲基苯胺贮备液；取贮备液适量，加流动相稀释，得到0.2 μg·mL-12，6-二甲基苯胺对照溶液。

(4)专属性考察溶液

高温破坏溶液：取供试品溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加水适量，水浴加热9 h，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

光照破坏溶液：取光照10 d的盐酸左布比卡因样品20.2 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.1.3 方法学考察

在上述色谱条件下，分别对盐酸左布比卡因有关物质进行专属性、检测限、溶液稳定性考察，并对3批盐酸左布比卡因样品的相关物质进行测定。

1.2.2 对映体纯度测定

1.2.2.1 色谱条件

色谱柱为研创MCDP手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为三乙胺醋酸溶液(取三乙胺7 mL、醋酸7 mL，加水至1000 mL)-甲醇(70∶30，体积比)；检测波长215 nm；流速0.5 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量10 μL。

1.2.2.2 溶液的制备

(1)供试品溶液

取盐酸左布比卡因样品适量，加水溶解并稀释，得到0.5 mg·mL-1的供试品溶液。

(2)系统适用性溶液

取盐酸布比卡因对照品适量，加水溶解并稀释，得到0.2 mg·mL-1的盐酸布比卡因溶液，即系统适用性溶液。

(3)专属性考察溶液

高温破坏溶液：取盐酸左布比卡因样品200 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；取贮备液1 mL置于10 mL量瓶中，加水适量，水浴加热9 h，加水稀释至刻度，摇匀，滤过；取续滤液1 mL置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

光照破坏溶液：取光照10 d的盐酸左布比卡因样品20.2 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；取1 mL置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.2.3 方法学考察

在上述色谱条件下，分别对盐酸左布比卡因对映体纯度进行专属性、峰归属、检测限、重复性考察，并对3批盐酸左布比卡因样品的对映体纯度进行测定。

2 结果与讨论

2.1 盐酸左布比卡因有关物质测定

2.1.1 专属性

取各专属性考察溶液，按1.2.1.1色谱条件进样测定，计算理论塔板数和分离度，结果见图1。

a.高温破坏 b.光照破坏

由图1可知，盐酸左布比卡因峰与相邻降解产物峰能达到有效分离，分离度大于1.5；理论塔板数(以盐酸左布比卡因计)大于10 000。

2.1.2 检测限

取盐酸左布比卡因对照品适量，加流动相溶解并稀释得到0.02 μg·mL-1盐酸左布比卡因溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，盐酸左布比卡因峰信噪比为3.3,即盐酸左布比卡因检测限浓度为0.02 μg·mL-1。

取2，6-二甲基苯胺适量，加流动相稀释得到0.7 ng·mL-12，6-二甲基苯胺溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，2，6-二甲基苯胺峰信噪比为2.5，即2，6-二甲基苯胺检测限浓度为0.7 ng·mL-1。

2.1.3 溶液稳定性

取供试品溶液于室温分别放置0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h，进样测定。结果表明，溶液在12 h内稳定，RSD为0.6%。

2.1.4 样品有关物质测定

取3批盐酸左布比卡因样品分别制备的供试品溶液及对照溶液、2，6-二甲基苯胺对照溶液，各进样20 μL，记录色谱图，如图2所示。以不加校正因子的主成分对照法计算最大单个杂质和总杂质，以外标法计算2，6-二甲基苯胺含量。结果表明，3批盐酸左布比卡因样品中均未检出有关物质。

a.供试品溶液 b.对照溶液 c.2，6-二甲基苯胺对照溶液

2.2 对映体纯度测定

2.2.1 专属性

取各专属性考察溶液，按1.2.2.1色谱条件进样测定，计算理论塔板数和分离度，结果见图3。

a.高温破坏 b.光照破坏

由图3可知，盐酸左布比卡因峰与相邻降解产物及其对映体峰能达到有效分离，分离度大于1.5；理论塔板数(以盐酸左布比卡因计)大于2000。

2.2.2 峰归属

取系统适用性溶液10 μL注入液相色谱仪，出现2个主峰，分别为R-(+)型与S-(-)型盐酸布比卡因。

取供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，出现1个主峰，应为R-(+)型或S-(-)型盐酸布比卡因。取2%的水溶液测定比旋度为-12.5°，说明供试品为左旋体。因此可确定该色谱条件下对映体出峰顺序为：先R-(+)型盐酸布比卡因峰、后S-(-)型盐酸布比卡因峰。

2.2.3 检测限

取盐酸布比卡因对照品适量，加水溶解并稀释得到0.4 μg·mL-1盐酸布比卡因溶液，取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，R-(+)型与S-(-)型盐酸布比卡因峰信噪比分别为3.3和3.2，则该方法R-(+)型与S-(-)型盐酸布比卡因检测限浓度均为0.2 μg·mL-1。

2.2.4 重复性

取系统适用性溶液10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。结果表明，R-(+)型盐酸布比卡因峰与S-(-)型盐酸布比卡因峰分离度均大于1.5；计算AR/(AS+AR)的值[AR、AS分别表示R-(+)型盐酸布比卡因与S-(-)型盐酸布比卡因峰面积]，平均为52.0%。表明该方法重复性良好。

2.2.5 对映体纯度测定

取3批盐酸左布比卡因样品分别制备的供试品溶液及系统适用性溶液，各进样10 μL，记录色谱图。计算AR/(AS+AR)，结果表明，3批盐酸左布比卡因样品中均未检出盐酸右布比卡因，色谱图见图4。

a.系统适用性溶液 b.供试品溶液

2.3 讨论

(1)pH值对盐酸左布比卡因有关物质测定影响较为明显。盐酸左布比卡因峰的保留时间随pH值的减小而缩短。盐酸左布比卡因为碱性药物，在偏碱性的条件下有利于在色谱柱上保留。因此，最终选择pH值8.0的磷酸盐缓冲溶液作为流动相，相应地需选择耐碱性的色谱柱。

(2)三乙胺醋酸缓冲溶液是手性分离中常用的缓冲溶液。研究发现，缓冲溶液浓度越大对映体分离效果越好。最终确定以7 mL三乙胺与7 mL醋酸加水至1000 mL的缓冲溶液为最佳。

(3)本研究所讨论的盐酸左布比卡因的质量控制方法中，其有关物质测定所采用的HPLC方法无立体选择性，测定的实际是盐酸左布比卡因及其右旋对映体的总量，因此评价原料药质量时应当综合对映体纯度的测定结果。

3 结论

采用高效液相色谱法，以Dikma Platisil ODS柱测定盐酸左布比卡因有关物质；以研创MCDP手性柱测定盐酸左布比卡因对映体纯度。结果表明，盐酸左布比卡因与其中间体及降解产物之间分离良好；盐酸左布比卡因与其右旋对映体可完全分离(R>1.5)。该方法快速简便、准确可靠，可用于盐酸左布比卡因的质量控制。

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