高压氧预处理对正常和糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

谷莉娜 郑 杨 王奭骥 谷铁军 (吉林大学第一医院，吉林 长春 3002)

细胞凋亡(Apoptosis)，又称细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。近年研究发现，细胞凋亡参与心肌梗死心肌细胞的死亡，并在心室重构、心功能改变过程中起关键作用〔1〕。本研究观察高压氧预处理对正常和糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响，并检测正常和糖尿病大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 75只健康成年雄性Wistar大鼠，体重250～350 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

1.2 仪器及试剂 动物实验高压氧舱(烟台冰轮高压氧舱有限公司);BL-420生物机能试验系统(成都泰盟科技有限公司);电子天平ESJ60-4(沈阳龙腾电子有限公司);电子天平HX5CC1(慈溪市天东衡器厂);灌流液滤过装置(吉林大学基础医学院药理学院);Langerdorff离体灌流装置(沈阳国药集团定制);光学显微镜BX51(日本OLYMPUS公司 );石蜡切片机RM 2245(德国LEICA公司);免疫组化检测试剂盒和Bcl-2、BaX抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 2型糖尿病(T2DM)动物模型建模方法 取45只成年雄性Wistar大鼠高脂饲料(88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和0.2%胆盐)饲养1个月后给予大鼠2%STZ一次性腹腔注射(40 mg/kg)，1 w后取尾血测血糖，以血糖＞16.7 mmol/L为糖尿病模型成功。大鼠继续常规饲料喂养2个月。

1.3.2 分组及干预 将75只大鼠分为正常组(30只)和糖尿病组(45只)。正常组分为正常对照组(N-C组，n=10):以KH液持续灌流120 min;正常缺血-再灌注组(N-I/R组，n=10):以K-H液稳定灌流 20 min后，停止灌流 30 min，再灌注120 min;正常高压氧预处理组(N-P组，n=10):该组大鼠经过高压氧预处理后，其余实验方法同I/R组。造模成功的T2DM大鼠随机分为糖尿病对照组(DM-C组，n=10):以K-H液持续灌流120 min;糖尿病缺血-再灌注组(DM-I/R组，n=10):以KH液稳定灌流20 min后，停止灌流30 min，再灌注120 min;糖尿病高压氧预处理组(DM-P组，n=10):该组大鼠经过高压氧预处理后，其余实验方法同I/R组。高压氧预处理的方法:每天先洗舱，以保证舱内处于纯氧状态。然后将大鼠放进动物实验高压氧舱内，以0.2 ATA/min注入纯氧，至压力达到2.0 ATA(标准大气压)。当压力稳定后，将大鼠放置60 min。达到规定时间后，以0.2 ATA/min排放舱内氧气，至舱内压力恢复至正常。1次/d，共7 d。

1.3.3 离体大鼠心脏灌流(Langendorff)模型 Langendorff模型是在恒温恒压条件下，从主动脉根部用氧饱和的K-H灌流液逆向灌流，因逆向灌注关闭了主动脉瓣，类似于在体心脏处于舒张期，停止灌流即模拟全心缺血状态，恢复灌流即全心再灌注开始。具体步骤:取大鼠，秤体重，按5 ml/kg给予20%乌拉坦腹腔注射麻醉后，置于动物台上，固定四肢。迅速开胸取出心脏并立即置于4℃ K-H缓冲液中，轻轻挤压心室，使心腔中残余血排除。开启Langendorff灌流装置，流量约10 ml/min于液面下在1 min内迅速把主动脉接于灌流的套管上，将大鼠心脏悬挂于Langendorff装置上，并以丝线结扎固定。用95%O2～5%CO2平衡的37℃ K-H液行主动脉逆行恒压灌流，灌流压力为80 cmH2O。剪去左心耳，将带有水囊的压力换能器(事先应排尽空气)通过左心房插入左心室。压力换能器的另一端接于BL-420生物机能试验系统，由其记录血流动力学变化。

1.3.4 标本制备 灌流毕，速取心脏于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，每隔1 mm横断面切数张4 μm厚的切片，分别做HE染色、心肌细胞凋亡、Bax与Bcl-2表达检测。

1.3.5 TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡 取各组心肌细胞切片放入4%甲醛溶液固定，按TUNEL试剂盒说明书原位检测凋亡细胞，细胞核呈黄褐色为凋亡细胞。每张切片随机计数5个以上视野，分别计算每个视野细胞核数及凋亡阳性细胞核数，根据如下方法计算凋亡指数(AI)，AI(%)=凋亡阳性的细胞核数/总计数的细胞核×100%。

1.3.6 采用免疫组化法检测Bcl-2与Bax表达 利用图形分析系统分别对细胞凋亡和Bcl-2与Bax阳性细胞灰度值进行测定，求取每个视野均值代表该切片的测量值，以表示其染色强度。平均灰度值与阳性细胞表达成反比，平均灰度值越高，表示指标的阳性染色数量越少;平均灰度值越低，表示指标的阳性染色数量越多。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，计量资料以表示，组间数据比较用t检验。

2 结果

2.1 心肌组织病理学分析 图1可见，染色见正常对照组大鼠心脏结构完整、清晰，心肌细胞排列整齐略松散，偶见炎细胞浸润。正常缺血-再灌注组:心肌细胞排列不规则，细胞肿胀可见心肌细胞质嗜酸性增强，有大量炎细胞浸润;正常高压氧预处理组:心肌细胞排列较规则，细胞略肿胀，可见心肌细胞质嗜酸性增强，有少量炎细胞浸润，病变较正常缺血再灌注组轻;糖尿病大鼠对照组见心脏结构完整、清晰，心肌细胞排列较为整齐，偶见炎细胞浸润及胞质嗜酸性略增强;糖尿病大鼠缺血-再灌注组见心肌细胞排列不规则，细胞肿胀可见心肌细胞质嗜酸性增强，有大量炎细胞浸润;糖尿病高压氧预处理组见心肌细胞排列不规则，细胞肿胀可见心肌细胞质嗜酸性增强，有少量炎细胞浸润，病变较糖尿病缺血再灌注组轻。

2.2 心肌细胞凋亡变化 图2可见，正常及糖尿病对照组均可见少量阳性凋亡细胞;正常及糖尿病缺血-再灌注组心肌细胞凋亡均明显增多，但糖尿病缺血-再灌注组比正常缺血-再灌注组凋亡增多更明显;正常及糖尿病高压氧预处理组仍可见较多凋亡细胞，但比缺血-再灌注组明显减少，其中正常大鼠高压氧预处理组凋亡细胞减少更明显。见表1。

图1 心肌组织病理学分析(HE，×200)

图2 心肌细胞凋亡变化(TUNEL染色，×200)

表1 心肌细胞凋亡指数(，%)

表1 心肌细胞凋亡指数(，%)

与N-C组比较:1)P＜0.05;与N-I/R组比较:2)P＜0.05;与DM-C组比较:3)P＜0.05;与DM-I/R组比较:4)P＜0.05，下表同

10 5.0±0.98 N-I/R组 10 41.72±3.471)N-P组 10 33.15±4.362)DM-C组 10 8.56±2.33 DM-I/R组 10 52.73±6.713)DM-P组 10 41.69±5.794)凋亡指数N-C组组别 n

2.3 心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达水平 正常及糖尿病缺血-再灌注组Bcl-2的表达均明显减少，Bax的表达均明显增多，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，但糖尿病组更为明显;正常及糖尿病高压氧预处理组Bcl-2的表达均明显增多，Bax的表达均明显减少，与缺血-再灌注组比较有统计学意义(P＜0.05)，但正常组更明显。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达的平均灰度比较(，n=10)

表2 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达的平均灰度比较(，n=10)

127±9.12 177.67±4.59 N-I/R组 171.83±8.661) 157.50±8.121)N-P组 158.67±7.692) 170.17±7.352)DM-C组 150.33±7.65 149.33±7.94 DM-I/R组 183.33±9.153) 134.0±4.733)DM-P组 166.0±10.534) 141.17±6.774)Bcl-2 Bax N-C组组别

3 讨论

糖尿病是冠心病的主要危险因素，急性心肌梗死糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。已发现，在糖尿病损伤的心肌组织中存在着大量的凋亡细胞〔2，3〕，心肌细胞凋亡可能是心脏结构和功能发生改变的关键因素。Bcl-2和Bax基因是调控凋亡的主要基因，Bcl-2基因是一原癌基因，能抑制细胞凋亡，其过量表达可阻断因缺血、细胞因子短缺、辐射、抗肿瘤药物、cmyc等不同刺激诱发的细胞凋亡。Bcl-2抑制凋亡的机制是它可直接或间接地阻止细胞色素自线粒体的释出，而后者可与ATP一起改变Apaf-1的构型而使caspase-9激活。Bax基因为促进凋亡基因，主要表达于线粒体膜和内质网膜上。Bax与Bcl-2有很高的同源性，能与Bcl-2形成异源二聚体，通过抑制后者的活性，使凋亡易于发生。Bcl-2和Bax的表达程度决定了细胞命运，Bcl-2占优势时阻止细胞凋亡发生，而Bax占优势时细胞趋向凋亡。

人们把超过1个大气压的压力称高气压。在高气压环境中吸入高浓度氧或纯氧，使氧压或氧分压大于常压纯氧水平的氧，即称为高压氧。高压氧条件下可使物理溶解氧量显著增多，可使局部血管扩张，增加该地区的血流量，可明显改善缺血、缺氧组织血供，增强微循环功能。高压氧作用下氧的有效弥散半径加大，弥散深度和范围增加，这就使得在一般常压下无法深达的组织细胞可获得足够的氧的供应，增加组织储氧量，纠正缺氧。因此高压氧广泛应用于治疗缺血缺氧性疾病。研究表明〔4～7〕，高压氧预处理可减轻大鼠的心肌缺血-再灌注损伤。但高压氧预处理对大鼠心肌细胞凋亡的影响，特别是对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响至今未见报道。

本实验利用离体灌流模型观察高压氧预处理对正常和糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响。本实验表明正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注组与对照组相比心肌细胞凋亡明显增多，Bcl-2的表达明显减少，Bax的表达明显增多，其中糖尿病缺血-再灌注组心肌细胞凋亡比正常大鼠缺血-再灌注组心肌细胞凋亡更为明显，给予高压氧预处理后正常及糖尿病大鼠凋亡细胞均明显减少，Bcl-2的表达明显增多，Bax的表达明显减少，与缺血-再灌注组比较有统计学意义。说明高压氧预处理可减轻正常及糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡，对正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注心肌细胞均具有保护作用，其中对正常大鼠的保护作用更强。关于高压氧预处理如何实现其抗细胞凋亡，涉及的信号转导通路及行高压氧预处理的最佳疗程尚有待进一步研究。

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