萎缩性胃炎大鼠p16，bcl-2，PCNA的表达及叶酸的预防作用

陈海金 王惠吉 (福建医科大学附属协和医院急诊科，福建 福州 35000)

慢性萎缩性胃炎与胃癌关系密切。胃黏膜发生恶性变的过程中，不仅存在细胞增殖的异常，同时细胞凋亡机制的异常也发挥了重要作用。叶酸已被应用于预防肝癌和结肠癌等多种肿瘤，逆转癌前病变，但关于叶酸对胃黏膜萎缩的预防及治疗研究很少。随着人体年龄的增长，胃黏膜组织发生退行性萎缩非常普遍，老年群体对疾病反应不敏感，一旦检出胃癌已进入进展癌，甚至晚期癌。因此从病理检查及分子生物学对萎缩性胃炎进行研究十分必要，本文探讨萎缩性胃炎的细胞增殖调控改变及叶酸对其预防作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和制模方法 健康雄性清洁级SD大鼠，鼠龄7 w，体重210～240 g，共40只，随机分成对照组10只，模型组及叶酸预防组各15只，对照组自由进食及进水，参照文献〔1〕，造模组采用三种损伤因素联合作用，0.1%氨水自由饮用(氨水每天新鲜配制)，20 mmol/L脱氧胆酸钠8 ml/kg每天灌胃，60%酒精8 ml/kg每三天空腹灌胃一次(前一天晚上撤除饲料)。叶酸预防组造模同时，以 0.5 mg/ml叶酸溶液5 mg·kg－1·d－1灌胃，共6个月。动物每周测量体重，根据体重变化调整药物剂量。

1.2 药品及试剂 氨水:由北京化工厂生产，25% ～28%，分析纯，批号:20041102;乙醇:由北京化工厂生产，95%，分析纯，批号:20050104;脱氧胆酸钠:SERVA进口分装，沪试，批号:F20031018;叶酸:天津飞鹰制药有限公司，5 mg/片，批号:20050210;叶酸试剂盒:美国BECKMAN COULTER公司;PCNA免疫组化试剂:兔多克隆抗体，1∶100稀释，Santa Cruz，sc-7907;p16免疫组化试剂:小鼠单克隆抗体，1∶100稀释，Santa Cruz，sc-1661;bcl-2免疫组化试剂:1∶80稀释，DAKO，H712430;二抗:Envision试剂(为即用型试剂，购自Dako公司)。

1.3 标本制作及指标检测

1.3.1 标本制备 动物处死前禁食24 h，将大鼠以50 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，沿正中线剪开腹腔及胸腔，以10 ml注射器刺入心脏取血，后取出全胃，沿胃大弯剪开，于冰盐水中冲洗干净。取病理标本后，胃黏膜吸去水分，刮取胃黏膜，用电子天平称重，尽快放入含0.2 mol/L醋酸的匀浆器中，醋酸的量按100 μg胃黏膜组织加100 μl计算，轻轻碾磨，制成匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液，取血后静置2 h后3 000 r/min离心15 min，取上清液，－20℃以下冰箱保存，试验结束后统一检测。病理标本沿胃小弯及大弯纵行取材，包括前胃，腺胃，十二指肠全长，宽约4 mm，置入10%中性甲醛溶液，固定8～24 h，经全自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色观察胃黏膜萎缩情况。

1.3.2 叶酸检测 由化学发光仪自动检测，浓度过高则适度稀释重测。

1.3.3 病理组织学观察 萎缩性胃炎分级按照悉尼分级系统进行，即腺体减少1/3位轻度萎缩，减少在1/3～2/3之间中度萎缩，减少2/3以上为重度萎缩。

1.3.4 PCNA，p16，bcl-2蛋白检测 免疫组化法检测PCNA、p16、bcl-2在胃黏膜的表达。用已知阳性标本作阳性对照。用PBS代替一抗，结果应为阴性。阳性为棕黄色或棕褐色，并呈颗粒状，背景呈紫蓝色。p16及bcl-2阳性细胞在5%以下为阴性，5%以上为阳性。光镜下观察PCNA染色切片5个具有代表性的高倍视野，分别计数200个细胞，共计1 000个细胞，计算出PCNA阳性细胞百分比即增殖指数(PI)。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行数据的统计分析，结果以表示。计量资料先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件的进行方差分析，否则作秩和检验。计数资料行χ2检验。

2 结果

2.1 动物一般情况 正常对照组大鼠被毛紧密贴身，色白光泽，两眼有神，活动敏捷，食量较多，随体重增加而增加，后期食量稳定，大便呈颗粒状，尾色淡红;模型组大鼠被毛松散蓬乱，毛色偏黄无光泽，眼眯无神，活动少而迟钝，拱背，喜扎堆，形体瘦小，食量下降，多数大鼠出现便溏及拉尾现象，尾色淡白或苍白，3组大鼠体重均呈上升增长趋势，但模型组大鼠体重增加缓慢，至8 w时，已显著低于对照组(P＜0.01)，叶酸预防组各时间段体重均高于模型组(P＜0.01)，第18周起体重甚至有所下降，死亡增多。试验结束时模型组共死亡3只，叶酸预防组死亡4只，对照组没有自然死亡，见表1。

表1 各组大鼠试验过程中体重变化(，g)

表1 各组大鼠试验过程中体重变化(，g)

与同期对照组比较:1)P＜0.01

__组别 0月 第2月 第4月 第6月对照组 239.66±6.06 469.88±30.95 567.63±33.01 654.17±43.9(n) (10) (10) (10) (10)模型组 234.34±7.27 351.68±47.901)432.74±54.471)381.92±47.261)(n) (15) (15) (14) (12)叶酸组 236.47±6.52 362±41.26 456±47.94 477±43.29__(n)__________(15)________________________________________________(14)__(13)(11)

2.2 病理组织学观察

2.2.1 肉眼观察 正常对照组胃黏膜色泽淡红，表面光滑，无颗粒感，附有较多黏液，黏膜皱襞完整，厚薄适中。造模组可见:大部分大鼠出现胃肠胀气，胃黏膜有充血、糜烂、溃疡等病变，胃黏膜色紫暗，表面黏液较少，表面粗糙有颗粒，皱襞减少但粗大，胃黏膜变薄，并可见黏膜下血管，见图1。

图1 大鼠胃黏膜大体观

2.2.2 光镜观察 正常大鼠胃黏膜内偶可见少量淋巴细胞及嗜酸细胞，胃窦小凹和腺体厚度约1∶1，腺体排列整齐，模型大鼠胃窦黏膜有大量淋巴细胞浸润及少量中性粒细胞，部分有成堆淋巴细胞聚集灶，腺体有不同程度的排列紊乱，稀疏，胃小凹变宽，稀疏，腺体层变薄腺体部纤维结缔组织增生，黏膜肌层增厚，向黏膜固有层伸展呈分支状插入腺体之间。根据萎缩性胃炎诊断标准，造模组基本达到中度萎缩性胃炎，少数为轻度或重度萎缩性胃炎。叶酸预防组与对照组比较病变仍然明显腺体变薄及腺体减少，但胃体壁细胞与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)，胃窦黏膜腺体厚度及腺体数目与模型组比较有所改善，病变相对不严重，腺体数目与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)。定性诊断发现叶酸预防组有减轻趋势，但无统计学差异见(P ＞0.05)，见表2、表3，图2。

2.3 血清及胃黏膜组织叶酸水平 模型组大鼠血清及胃黏膜组织中叶酸与对照组比较有所降低，但无统计学差异(P＞0.05)。叶酸预防组血清及胃黏膜组织叶酸较造模组及正常组明显上升(P＜0.05)，见表4。

表2 各组胃黏膜萎缩定性结果

表3 各组胃黏膜病理计量结果()

表3 各组胃黏膜病理计量结果()

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 对照组(10) 模型组(12) 叶酸预防组(11)64.09±19.54胃窦腺体数目 67.38±4.66 35.67±7.751) 46.64±12.622)胃体大弯腺体厚度(μm)450.50±46.29 437.25±60.00 446.27±53.06胃体小弯腺体厚度(μm)360.38±44.00 327.83±41.33 332.28±39.79胃体壁细胞数 177.25±31.51 129.08±30.211)149.91±29.462)胃窦厚度(μm) 102.38±14.65 52.25±19.341)

表4 血清及胃黏膜组织叶酸水平()

表4 血清及胃黏膜组织叶酸水平()

与模型组比较:1)P＜0.01

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图2 大鼠胃窦黏膜(×40)

2.4 胃黏膜PCNA，p16，bcl-2表达情况 PCNA主要表达于细胞核，在对照组大鼠胃黏膜中呈带状分布，主要位于腺体颈部，上皮及腺体底部表达很少。模型组大鼠胃黏膜PCNA表达较对照组明显增加(P＜0.01)。bcl-2表达于细胞质，在正常胃黏膜低表达，在模型组表达阳性面积增加，较对照组增加(P＜0.01)。p16阳性表达主要位于细胞核，在对照组大鼠高表达，模型组表达阳性面积较对照组有明显降低(P＜0.01)。叶酸预防组较模型组PCNA和bcl-2表达均明显下调(P＜0.05)，但PCNA在叶酸预防组仍比对照组明显增高(P＜0.05)，而p16蛋白两组之间无差异(P＞0.05)，见表5～表7，图3～图5。

表5 PCNA在各组中的表达

表6 bcl-2在各组中的表达

表7 p16蛋白在各组中的的表达

图3 p16蛋白在大鼠胃黏膜的表达(×100)

图4 bcl-2蛋白在大鼠胃黏膜的表达(×100)

图5 PCNA在大鼠胃窦黏膜的表达(×100)

3 讨论

目前认为，凡引起胃窦炎的因素持续存在或再生不良是导致萎缩性胃炎的病因。本实验萎缩性胃炎表现，与人类萎缩性胃炎极为相似。

PCNA对DNA复制起重要作用，可较好地反映细胞增殖状态。研究证实，萎缩性胃炎组织中细胞凋亡是明显增加的〔2〕。为了保持胃黏膜细胞总量，过量的细胞凋亡会诱发代偿性细胞增殖，如果损伤因素持续存在，胃黏膜持续增殖旺盛，将增加DNA自发复制错误的机会，也增加了外来因素对DNA损伤的机会，为细胞癌变提供有利的条件。bcl-2表达与肠型胃癌触发有关，而与其进展无关。p16蛋白表达低下是胃癌发生过程中的早期事件之一〔3〕。我们在大鼠实验性萎缩性胃炎中未观察到p16蛋白表达明显缺失，但存在蛋白表达程度的减少，同时我们发现其蛋白表达与PCNA蛋白表达呈负相关。本实验中，大鼠出现单纯萎缩性胃炎，虽未见明显肠上皮化生和异型增生，其bcl-2表达率为62.5%。我们在大鼠萎缩性胃炎中观察到凋亡抑制基因表达增加，这可能对细胞凋亡有所抑制，如果细胞增殖不减弱或增加，细胞增殖和细胞凋亡的平衡被打破，将有发展成胃癌的危险。

萎缩性胃炎作为一种癌前状态，有发展成肠型胃癌的可能，所以应积极预防。目前，叶酸已被应用于预防肝癌和结肠癌等多种肿瘤，逆转癌前病变。胃癌及癌前状态往往存在胃黏膜细胞内叶酸水平低下〔4〕，叶酸可以在一定程度上预防肿瘤的发生，其机制与维持DNA甲基化水平〔5〕，抑制鸟氨酸脱羧酶和酪氨酸激酶的活性〔6〕，和影响凋亡的发生〔7〕有关。我们选用叶酸对大鼠致萎缩的同时进行治疗发现，叶酸可以提高血清及为黏膜中叶酸水平，在一定程度上减轻胃黏膜组织学改变，但未达到完全逆转，叶酸能否预防萎缩性胃炎的发生，需要更长时间的观察。叶酸治疗后PCNA表达虽然与模型组比较虽然有所减少，但与对照组比较仍然很高，另外，叶酸可抑制bcl-2蛋白的表达水平，这在防止胃黏膜细胞恶性增殖可能有一定作用，使细胞增殖处于适度范围内。叶酸治疗后减少bcl-2蛋白表达升高及p16蛋白表达下降是否与叶酸维持DNA甲基化状态有关，以及是否尚有其他机制参与，有待进一步研究。

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7 刘正新，陈宝雯，杨桂彬，等.不同胃黏膜病变的细胞增殖变化规律及其意义〔J〕.中华内科杂志，2004;8(43):580-3.