林可霉素利多卡因凝胶微生物限度检查方法研究

杨淑先，赵新霞，牛坡（.河南省食品药品检验所，郑州市450003；.河南省人民医院，郑州市450003）

林可霉素利多卡因凝胶为外用半固体抗菌制剂，需要控制微生物限度。但由于该制剂中林可霉素为水溶性的抗菌成分，可抑制微生物的生长，因此，不能通过常规法进行该药品的微生物限度检查；另由于凝胶为水溶性的基质，但具有一定的黏度，直接用薄膜过滤法也难以去除抗菌成分。因此，需建立合适的方法对该样品进行微生物限度检查。笔者通过反复探索，经多次试验，最终选用以0.05 mol·L－1的四硼酸钠溶液[1]为稀释剂，采用薄膜过滤法进行本品的微生物限度检查。方法学验证结果表明，该方法有效、可行，可用于林可霉素利多卡因凝胶微生物限度检查。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HTY-2000A集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）；离心机（上海浦东物理光学仪器厂）；一次性使用薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限公司）；PYX-DHS细菌培养箱、MJ-160B霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 菌种

枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63 501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]均来源于中国药品生物制品检定所。

1.3 培养基[2]

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备[3]

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养22 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7 d，加入5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，再用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1 mL含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试品溶液的制备[1]

取样品10 g，加0.05 mol·L－1四硼酸钠溶液（85%磷酸溶液调节pH至7.0）至100 mL，边加边研磨，使供试品充分乳化，作为1∶10供试品溶液。

2.3 回收率的计算[4]

试验组的加菌回收率（%）＝[（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%；稀释剂对照组加菌回收率（%）＝（稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数）×100%。

2.4 细菌检查方法的验证

2.4.1 试验组[5]。取1 mL 1∶10供试品溶液，注入500 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，用45℃、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗量为每膜1 000 mL。在最后一次冲洗液中加入含50～100 cfu的试验菌菌悬液1 mL，过滤后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上。

2.4.2 菌液组[6]。取1 mL含菌数为50～100 cfu的试验菌菌悬液，注入平皿中，倾注营养琼脂培养基，培养。测定所加的试验菌数。

2.4.3 供试品对照组。取1 mL 1∶10供试品溶液，注入500 mL、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，用45℃、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗量为每膜1 000 mL。过滤后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上。

2.4.4 稀释剂对照组。取0.05 mol·L－1四硼酸钠溶液1 mL，注入500 mL、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，用45℃、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗，冲洗量为每膜1 000 mL。在最后一次冲洗液中加入含50～100 cfu的试验菌菌悬液1 mL，过滤后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上。

上述各组培养后按规定方法计算菌落数，计算回收率；试验平行3次。菌落计数结果见表1，回收率结果见表2，其中供试品对照组均为无菌生长（表1中菌落数为2个平皿的平均值）。

表1 菌落计数结果（cfu）Tab 1Results of colony coun（tcfu）

表2 回收率测定结果（%%）Tab 2Results of recovery tests（%%）

由表1、表2结果可知，3次试验中细菌回收率均大于70%。

2.5 霉菌和酵母菌计数方法的验证

2.5.1 试验组。取1∶10供试品溶液和含50～100 cfu的试验菌孢子悬液各1 mL，分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，培养。

2.5.2 菌液组。取含菌数为50～100 cfu的试验菌孢子悬液1 mL，注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，培养。测定所加的试验菌数。

2.5.3 供试品对照组。取1∶10供试品溶液1 mL，注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，培养。

2.5.4 稀释剂对照组。取0.05 mol·L－1四硼酸钠溶液和含50～100 cfu的试验菌孢子悬液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，培养。

上述各组培养后按规定方法计算菌落数，计算回收率；试验平行3次。菌落计数结果见表1，回收率结果见表2，其中供试品对照组均为无菌生长（表1中菌落数为2个平皿的平均值）。

由表1、表2结果可知，3次试验中霉菌和酵母菌回收率均大于70%。

2.6 控制菌检查方法的验证[7]

因样品为一般外用制剂，根据微生物限度要求，控制菌只做金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查。

2.6.1 试验组。取1∶10供试品溶液10 mL，注入500 mL、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，用45℃、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗量为每膜1 000 mL。在最后一次冲洗液中加入含10～100 cfu的铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌菌悬液1 mL，过滤后取出滤膜加至相应的100 mL培养基中培养，依相应菌的检查方法进行检查。

2.6.2 阴性菌对照组。方法同“2.6.1”项，只是加入菌悬液换为大肠埃希菌。

菌检结果见表3、表4（表中“+”表示菌生长，“-”表示未见菌生长）。

表3 铜绿假单胞菌控制菌验证方法试验结果Tab 3 Results of verification test for Pseudomonas aeruginosa

表4 金黄色葡萄球菌控制菌验证方法试验结果Tab 4 Results of verification test for Staphylococcus aureus

由表3、表4可见，试验组结果均为阳性，阴性菌对照组结果均为阴性，表明方法可行，结果符合要求。

3 讨论

（1）微生物限度检查法的方法学验证于2005年版《中国药典》执行以来，遇到了各种剂型的前处理问题，特别是具有抗菌活性的药品，既要保证彻底除去抗菌物质，又要注意所采用的方法对微生物的损伤程度[8]，因此，应对所采用的必需的试剂进行方法学的验证试验，保证所采用的方法为有效的方法。

（2）本品含量测定时采用高效液相色谱法，其含量测定供试液处理时既要通过薄膜过滤进样，又要保证林可霉素溶解完全通过滤膜。本试验借鉴了这种处理方法，达到既可过滤、又能使林可霉素通过滤膜去除其抑菌作用的优点，从而使微生物在薄膜上有效截留，并对四硼酸钠溶液的pH值进行了控制，同时也证明在四硼酸钠在本试验使用量下对微生物无毒性。

（3）在微生物限度检查中，对于必须采用薄膜过滤法的品种，最大的困难是过滤速度较慢，因为多数品种为非全溶性的品种，只能采取上清液进行过滤。本品虽然为水溶性凝胶，但因凝胶的黏度严重影响过滤速度，因此，在分散凝胶的同时，选择直径较大的滤器，也是解决问题的有效途径；另外也可采用温度不超过45℃的冲洗液，降低黏度，提高冲洗速度。

（4）在微生物限度检查中，对于没有合适检查方法的品种，要充分了解供试品的本身特性及处方组成[9]，甚至要了解有抗菌活性物质的抗菌谱，才有助于选择有效的方法，减少筛选的步骤[10]。本品中的林可霉素为抗细菌类抗生素，对真菌的抑制作用较弱，因此霉菌、酵母菌检查方法可直接试用常规法。细菌计数方法验证时采用薄膜过滤法，所用的冲洗量笔者曾以300、500、800、1 000 mL进行研究验证[11]，最后确定1 000 mL冲洗量可达到消除抑菌活性的作用，同时稀释剂对照组菌回收率亦均超过70%。对于难过滤的品种，在过滤的同时进行振摇，有助于提高过滤速度。

（5）微生物限度检查时所采用的处理措施必须保证对微生物无毒性，本文所采用的四硼酸钠溶液（0.05 mol·L－1）经验证对微生物无毒性，可以作为前处理溶剂。

（6）对于抑菌活性较强的品种，又无理想的方法去除抑菌物质，可以制备1∶20的供试液，降低抑菌物质的浓度，增大接种体积，保证接种总量不变。但同时平皿培养基的量或者液体培养基的量应相应增加，以保证微生物的生长环境。

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