余甘子提取物对尿酸钠诱导大鼠急性痛风性关节炎的作用研究Δ

岑志芳，张继平，李海燕，曾煦欣，吴剑峰#（.佛山科学技术学院，佛山市58000；.广东佛山市第二人民医院，佛山市 58000）

痛风是因长期嘌呤代谢障碍，高尿酸血症引起组织损伤的一组临床综合征。临床上可见高尿酸血症、特征性关节炎反复发作、痛风石形成，严重者可致肾尿酸结石和痛风性肾实质病变和其他并发症，严重危害人体健康。余甘子又名山油柑、油甘子、余甘果等，为大戟科叶下珠属植物余甘子（Phylllanthusemblica）的成熟果实[1]。民间一直有服用该药治疗痛风的习惯，并且与其他药材一起配制成复方使用，如藏药十五味乳鹏丸，对于关节红肿疼痛、发痒、痛风、黄水积聚就有良好疗效[2]。本文研究余甘子不同部位提取物对大鼠痛风性关节炎的防治作用及作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PV-200型足趾容积测量仪（成都泰盟科技有限公司）；水浴箱（浙江金坛市白塔金昌实验仪器厂）；UV-2450/2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；TGL-16G-A型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SN-695B型放免γ测量仪（上海原子核所日环仪器厂）。

1.2 试药

余甘子药材（采自广东汕头）经佛山科学技术学院李海燕副教授鉴定为真品；秋水仙碱片（西双版纳版纳药业有限公司，批号：101028）；尿酸钠（美国Sigma公司）；甲醇（江苏强盛化工有限公司，批号：20080729）；氢氧化钠（广东光华化学厂有限公司，批号：20040803）。

1.3 动物

SPF级SD大鼠80只，♂，体重180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供（动物生产合格证号：SCXK（粤）2008-0020）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 余甘子提取物的制备 取余甘子生药材适量，置于锥形瓶中，加入甲醇。加热连续回流4次，每次1.5 h，趁热过滤。将4次所得滤液减压蒸馏，回收甲醇，得到余甘子醇提浓缩液，呈浸膏状。取醇提物500 g，加适量蒸馏水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别提取出3个极性部位，最后的部分静置使其分出水相部分。得到各部分提取液后减压蒸馏，得到各部分浓缩液用于实验，余甘子醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物得率分别为0.85%、7.8%、13.35%、38.60%。

2.1.2 尿酸钠晶体溶液的制备 用194m L蒸馏水加6m L的1mol·L-1NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1mol·L-1HCl调pH值为7.2，搅拌冷却，4℃贮藏24 h，去上清液，用滤纸将沉淀物水分吸干，放入干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末[3]，放入研钵内研成细末，用孔径250μm的金属网筛过筛，制成尿酸钠结晶。取尿酸钠结晶加生理盐水，再加1m L吐温80，加热搅拌，得25mg·m L-1尿酸钠溶液。

2.2 模型的复制、分组与给药

实验分为8组，即空白对照、模型、秋水仙碱（0.8mg·kg-1）、石油醚部位（5 g·kg-1）、乙酸乙酯部位（5 g·kg-1）、正丁醇部位（5 g·kg-1）、水相部位（5 g·kg-1）、醇提物（5 g·kg-1）组。ig给药，每天1次，连续7 d。末次给药前，将大鼠的左后肢浸入足趾容积测定仪内，读取大鼠左后肢的正常足趾容积，连续3次，求其平均值作为正常值（此为0 h的足肿胀值）。末次给药1 h后，无菌操作，每只鼠左后足趾sc 0.2m L尿酸钠晶体溶液复制模型，分别于注射后1、2、4、6、8、12、24、48 h测定大鼠足趾容积。

2.3 余甘子提取物对大鼠24 h步态行为的影响

分别于复制模型24 h后观察各组大鼠的步态并进行评分分级，根据文献[4]标准进行评分：0分为正常步态，双足均匀着地；1分为轻度跛行，受试下肢略有弯曲；2分为中度跛行，受试下肢刚触及地面；3分为重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走。

2.4余甘子提取物对大鼠关节组织前列腺素E2（PGE2）含量的影响

各组大鼠测完最后时间点（复制模型后48 h）踝关节肿胀后，处死大鼠，距右踝关节上0.5 cm处剪下右足，称重，剥皮后浸泡于5m L生理盐水中1 h，以1 500 r·m in-1离心10m in，吸取上清液0.5m L，加入0.5mol·L-1氢氧化钠-甲醇溶液 2m L，于50℃水浴箱中水浴异构化20m in，加甲醇稀释至20m L后，参照文献[5]方法于紫外分光光度计278 nm波长处测定吸光度（OD），以每1 g炎性组织相当的OD值显示PGE2的含量。

2.5 余甘子提取物对模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量的影响

各组大鼠测完最后时间点（复制模型后48 h）踝关节肿胀后，乙醚麻醉取血，全血以3 000 r·min-1离心10min，取上清液，－20℃贮藏，放射免疫法测定TNF-α含量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 对模型大鼠踝关节肿胀的影响

与空白对照组同一时间点比较，模型组大鼠踝关节肿胀度均显著增加（P＜0.01），复制模型约0.5 h后开始肿胀，随后显著增加，大概在4 h时达到最高峰，提示复制模型成功。与模型组比较，余甘子醇提物组8、12、24 h时，余甘子乙酸乙酯部位组6、8、24、48 h时，余甘子正丁醇部位组在8、12、24、48 h时，余甘子水相部位组8、12、24 h时，余甘子石油醚部位组在24 h时显著降低（P＜0.05）。提示余甘子对模型大鼠踝关节肿胀有显著的抑制作用，尤其是醇提物、正丁醇部位、水相部位和乙酸乙酯部位作用较为明显。余甘子提取物对模型大鼠关节肿胀的影响见图1。

3.2 对模型大鼠24 h步态行为的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠活动减少，右后肢弯曲，行走时出现不同程度的跛行，大鼠24 h步态评分显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，余甘子醇提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、石油醚部位、水相部位组大鼠步态明显得到改善，评分显著降低（P＜0.05）。余甘子提取物对模型大鼠24 h步态行为的影响见表1。

3.3 对模型大鼠关节组织PGE2含量的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠关节组织PGE2含量显著提高（P＜0.01），提示关节局部炎症反应剧烈。与模型组比较，余甘子的醇提物、正丁醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位组大鼠关节组织PGE2含量显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。余甘子提取物对模型大鼠关节组织PGE2含量的影响见表2。

3.4 对模型大鼠血清TNF-α含量的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α的含量显著提高（P＜0.01）。与模型组比较，正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位组大鼠血清TNF-α含量显著降低（P＜0.05），说明余甘子可能通过抑制血清炎性介质释放从而减轻炎症反应。余甘子提取物对模型大鼠血清TNF-α含量的影响见表3。

表1 余甘子提取物对模型大鼠24 h步态行为的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effects of the extracts of P.emblica on 24 h gait behavior inmodel rat（s±s，n＝10）

表1 余甘子提取物对模型大鼠24 h步态行为的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effects of the extracts of P.emblica on 24 h gait behavior inmodel rat（s±s，n＝10）

与空白对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 vs.blank controlgroup：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

1分剂量2分3分组别24h步态评分0分空白对照组模型组＊秋水仙碱组#余甘子醇提物组#余甘子石油醚部位组#余甘子乙酸乙酯部位组#余甘子正丁醇部位组#余甘子水相部位组#－ -10 0.8mg·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 1 1 3 1 0 3 5 5 6 8 6 7 0 7 1 2 3 1 1 2

表2 余甘子提取物对模型大鼠关节组织PGE2的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effects of the extracts of P.emblica on PGE2 level of joint tissue inmodel rat（s±s，n＝10）

表2 余甘子提取物对模型大鼠关节组织PGE2的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effects of the extracts of P.emblica on PGE2 level of joint tissue inmodel rat（s±s，n＝10）

与空白对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白对照组模型组秋水仙碱组余甘子醇提物组余甘子石油醚部位组余甘子乙酸乙酯部位组余甘子正丁醇部位组余甘子水相部位组PGE2/mg·kg-1 6.65±3.02 46.91±20.31＊31.74±9.98#19.07±6.01##30.18±17.26#31.38±13.75#20.04±4.51##38.67±22.78剂量--0.8mg·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1

表3 余甘子提取物对模型大鼠血清TNF-α含量的影响（±s，n＝10）Tab 3 Effects of the extracts of P.emblica on serum TNF-α level inmodel rat（s±s，n＝10）

表3 余甘子提取物对模型大鼠血清TNF-α含量的影响（±s，n＝10）Tab 3 Effects of the extracts of P.emblica on serum TNF-α level inmodel rat（s±s，n＝10）

与空白对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.blank controlgroup：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.05

组别空白对照组模型组秋水仙碱组余甘子醇提物组余甘子石油醚部位组余甘子乙酸乙酯部位组余甘子正丁醇部位组余甘子水相部位组0.330±0.099 0.489±0.111＊0.370±0.086#0.430±0.101 0.356±0.059#0.374±0.095#0.336±0.103#0.393±0.131--0.8mg·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 5g·kg-1 TNF-α/ng·mL-1剂量

4 讨论

现代药理研究证明，余甘子乙醇和水提取物对醋酸所致的小鼠扭体反应有明显的镇痛作用；余甘子粉能显著抑制大鼠琼脂性足跖肿胀和二甲苯所致小鼠耳壳肿胀，显著抑制组胺所致的毛细管通透性增强和白细胞游出[5，6]。也有文献显示，余甘子醇提物乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌有强抑制作用[7]。本研究显示，余甘子提取物能显著改善模型大鼠关节肿胀程度、步态指数等关节炎的症状与指标，同时能显著降低模型大鼠关节组织PGE2与血清TNF-α水平，与上述文献结果相吻合。说明余甘子具有抗炎镇痛作用，其机制是抑制局部组织和血清炎症介质PGE2和TNF-α的释放。对石油醚、正丁醇、乙酸乙酯等5个提取部位的药效结果进行比较分析，发现正丁醇与乙酸乙酯对上述指标均有明显作用，醇提部位虽然对足肿胀、步态指数、组织PGE2有明显作用，但对血清TNF-α无影响，而且对足肿胀的有效时间只能持续到24 h，不如正丁醇部位与乙酸乙酯部位。本研究对象为大鼠急性痛风性关节炎模型，综合上述指标判断，余甘子抗痛风作用的有效部位主要在正丁醇和乙酸乙酯部位，本研究可为进一步探讨余甘子抗痛风作用机制奠定理论基础。

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