种番鸭呼肠孤病毒的分离及RT-PCR鉴定

施少华,万春和,程龙飞,傅光华,陈红梅,林 芳,林建生,黄 瑜

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建 福州 350013;2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建 福州 350013)

番鸭呼肠孤病毒病是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭病毒性传染病。该病主要发生于40日龄内番鸭,临床上以肝、脾表面坏死,纤维素性心包炎为主要病变[1]。目前该病有呈多致病型发生的态势[2]。

2010年1月,浙江省诸暨市某鸭场饲养4000羽240日龄种番鸭,按常规免疫程序进行了H5和H9亚型禽流感疫苗免疫。发病前产蛋率约20%(793枚/4000只),之后开始发病,3 d内共死亡17只,发病第4天后产蛋量下降到200枚。病鸭主要表现精神委顿、食欲不振、生长缓慢等。剖检可见种番鸭肝脏、胰腺、脾脏表面有少量白色坏死点等病变。经病原分离鉴定,初步认定该病原为呼肠孤病毒科成员。

1 材料与方法

1.1 酶、试剂及禽胚 Trizol购自Invitrogen公司;M-MLV Reverse Transcriptase、Go Taq DNA聚合酶购自 Promega公司;d NT P Mixture、DNA Marker DL-2000购自宝生物工程(大连)有限公司;琼脂糖为OXIOD公司产品;其他试剂为国产分析纯。试验用10日龄番鸭胚来源于福建莆田某健康种鸭场。

1.2 病原分离 无菌采集呈典型病变的种番鸭肝脏,处理后接种于血琼脂平板培养基,于37℃有氧和厌氧培养48 h,观察有无细菌生长。同时将种番鸭的肝脏剪碎后按照组织重量1∶4加入灭菌PBS,反复冻融3次后8000 r/min离心5 min,取上清用0.22μm的过滤器除菌,滤过液经尿囊腔接种10日龄番鸭胚6枚,0.2 mL/胚;同时接种灭菌PBS作为对照。每天观察2次。收集24～96 h死亡鸭胚的尿囊液,进行无菌检查和鸡红细胞凝集试验后,-20℃保存备用。

1.3 RT-PCR鉴定及序列分析

1.3.1 引物设计与合成 参照文献[3],可扩增番鸭呼肠孤病毒S1基因,其理论扩增长度为300 bp,由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3.2 RNA提取及反转录 取病毒株感染的鸭胚尿囊液于10000 r/min(4℃)离心10 min以去除杂质,收集上清液参照Trizol说明书操作对病毒RNA进行提取,最后每250μL尿囊液的病毒RNA用5 μL DEPC水溶解。反转录按 M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行,具体如下:将制备好的RNA 5μL,加入200 pmol/μL 随机引物 1μL,MMLV RT 5×Buffer 4μL,2.5 mmol/L d NTP Mixture 8 μL,40 U/μL Ribonuclease Inhibitor 1 μL,200 U/μL M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL,混匀后按以下程序进行RT:30℃10 min,37℃60 min,99℃5 min,保存于4℃。

1.3.3 PCR扩增 PCR反应体系为25μL:取2 μL反转录产物,2×Go Taq Mix Buffer 12.5μL,上、下游引物各1μL,dd H2 O补齐至25μL后按以下程序进行PCR:95℃变性3 min后,94℃变性40 s,53℃退火40 s,72℃延伸40 s,共35循环,最后72℃延伸10 min,保存于4℃。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4 克隆测序 PCR产物回收纯化后连接到p MD18-T载体,转化入DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12～16 h,挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200 r/min振荡过夜,取2μL菌液按1.3进行PCR鉴定,结果阳性者送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1.3.5 序列比对分析 将所获得的测序结果用DNAStar软件包MegAlign程序进行比对,并分析种番鸭呼肠孤病毒ZJ-10-06株的遗传进化关系。

2 结果

2.1 病原分离 从病死鸭肝脏取样接种于血琼脂平板,37℃培养后48 h未发现有细菌生长,基本排除细菌感染的可能。病料样品接种鸭胚后在48～96 h死亡,可见胚体全身水肿、出血,肝脏表面出血或有白色坏死点。收集死亡鸭胚的尿囊液,经检验无细菌污染和病毒无血凝活性,暂命名为ZJ-10-06株。

2.2 RT-PCR鉴定 用番鸭呼肠孤病毒特异性引物对ZJ-10-06株进展扩增,产物的电泳结果见图1。如图所示,特异性引物能成功扩增出1条300 bp的电泳条带,而空白对照则无法扩增出特异条带。

图1 番鸭呼肠孤病毒ZJ-10-06株的RT-PCR检测

2.3 基因序列分析 将所扩增的300 bp的目的片段进行回收纯化、克隆测序,所获序列的比对结果见表1,试验株ZJ-10-06株与番鸭呼呼肠孤病毒HC/China株同源率最高,为95.8%,与法国番鸭呼肠孤病毒株89026的同源率为89.9%,与我国病毒株MW9710株的同源率为93.8%。通过构建的系统进化树可以发现法国番鸭呼肠孤病毒株89026与我国番鸭呼肠孤病毒的遗传进化关系相对较远,而后者也可分为2分支,ZJ-10-06与HC/China病毒株共聚一分支(II支)(图2)。

图2 番鸭呼肠孤病毒ZJ-10-06株的遗传进化分析

3 讨论

鸭呼肠孤病初见于南非学者的描述,之后相继在法国、以色列、意大利、德国等国发生[1]。该病在我国福建、浙江、广东等省主要养鸭区均有发生。目前国内外多见于雏番鸭感染呼肠孤病毒的报道,而在大日龄种番鸭感染此病毒则鲜为介绍。

本试验自以肝脏、胰腺、脾脏表面出现的白色坏死点为特征的典型病死种番鸭脏器中分离到病毒,经对分离的病毒株进行RT-PCR鉴定及序列分析表明,初步确定ZJ-10-06株病毒为呼肠孤病毒。之后仍将从理化特性、血清学特性和分子生物学特性等方面加以佐证。

序列分析表明,ZJ-10-06与引起鸭脾坏死症HC/China病毒株同源率最高;从遗传进化关系上看,ZJ-10-06与HC/China病毒株共聚于II支,而与法国番鸭呼肠孤病毒89026和我国病毒株MW9710关系较远,表明了番鸭呼肠孤病毒S1基因序列发生了变异。

表1 番鸭呼肠孤病毒ZJ-10-06株与参考株的核苷酸同源性分析

[1] 胡奇林,陈少莺,林锋强,等.番鸭呼肠孤病毒的鉴定[J].病毒学报,2004,20(3):242-248.

[2] 黄瑜,苏敬良,施少华,等.我国鸭呼肠孤病毒感染相关的疫病[J].中国兽医杂志,2009,45(7):57-58.

[3] 胡奇林,林锋强,陈少莺,等.应用RT-PC R技术检测番鸭呼肠孤病毒[J].中国兽医学报,2004,24(3):231-232.