组织蛋白D和E-钙黏附蛋白与乳腺癌患者预后的关系

马思泉

山东省菏泽市第二人民医院胸外科，山东菏泽 274005

乳腺癌近年来发病率呈直线上升趋势，而且发病年龄趋于年轻化，而远处转移是患者的主要死亡原因。目前患者体内存在的微小转移癌灶尚难发现，早期筛选出具有转移危险性的患者，予以彻底控制是提高乳腺癌疗效的关键。本研究旨在探讨组织蛋白酶D（cathepsin D，Ca-D）和E-钙黏附蛋白（epithelial Cadherin， E-Ca）在乳腺癌组织中的表达情况，并预测其在预后估计中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集笔者所在医院2002～2008年手术切除后经病理证实，且有3年以上随访资料的女性乳腺癌患者106例作为研究对象，同时选取乳腺增生性病变即纤维腺瘤作为对照。患者年龄21～81岁，采取乳腺癌根治或改良根治术。患者术前未经过任何治疗，术后进行正规化疗。

1.2 分组

按照同侧腋窝淋巴结有无转移及转移个数分为3组：无淋巴结转移者为第1组，转移个数1～3个（含3个）者为第2组，转移个数4个或4个以上者为第3组。

1.3 染色方法及结果判断标准

采用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶法（S-P法）染色法（S-P试剂盒及一抗均购自福州迈新公司），DAB显色，实验步骤严格按照说明书进行。用已知阳性切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断

采用双盲法。阳性结果呈棕黄色颗粒状，随机选取10个高倍视野，计算着色肿瘤细胞占细胞总数的百分比。按照参考文献对不同抗体染色结果进行判断，CD34染色标记血管内皮细胞，先在低倍镜下找到新生血管密集区，在200倍视野下观察、计数5个视野下血管总数，取其平均值作为该患者的微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.5 统计学分析

采用SPSS1.0统计软件处理。

2 结果

2.1 一般资料

以观察满3年时患者生存状态为判断依据，其中无瘤存活者55例（文中以后称无复发组），出现局部复发或远处转移者51例（文中以后称复发组）。肿瘤发生部位左侧（61例）多于右侧（45例）。混合性癌12例，浸润性导管癌77例，浸润性小叶癌17例（分析数据时将混合型和小叶癌合并），浸润性导管癌明显多于小叶癌，两者比例约4.5∶1。

2.2 E-Ca在乳腺癌组织中的表达及临床意义

2.2.1 E-Ca蛋白在乳腺组织中的表达 E-Ca在正常乳腺癌组织内呈强表达，在癌组织内表达减弱。E-Ca的阳性率在浸润性小叶癌中为51.7%（15/29），导管癌中为76.4%（55/72），两组差异有统计学意义。

2.2.2 E-Ca蛋白表达相关因素 E-Ca蛋白表达与淋巴结转移呈相关趋势，低表达者容易发生淋巴结转移。淋巴结转移灶E-Ca蛋白表达降低。E-Ca蛋白表达与复发、部位、肿瘤大小、生存期均无关。

2.3 Ca-D在乳腺癌组织中的表达及临床意义

2.3.1 Ca-D在乳腺癌组织内的表达 Ca-D在正常乳腺癌组织内无表达或微弱表达，在肿瘤组织内表达明显增强。Ca-D在乳腺肿瘤实质细胞和间质细胞内都有不同程度的表达，不同肿瘤表达部位有所不同。

2.3.2 Ca-D在乳腺癌组织不同部位表达相关因素 分别观察Ca-D在乳腺肿瘤实质细胞和间质细胞内的表达，结果发现：①间质内Ca-D的表达与淋巴结转移、复发呈正相关：低表达组淋巴结转移率为50%（12/24），复发率为33.3%（8/24），中表达组转移率为60.7%（17/28），复发率为42.9%（12/28），强表达组转移率为79.1%（34/43），复发率为69.8%（30/43）； 强表达组转移、复发率高，与生存期呈负相关。②肿瘤实质内Ca-D的表达与淋巴结转移、生存状态及生存期无关。

Ca-D表达与肿瘤大小、病理类型、年龄无关。

2.4 乳腺癌组织中MVD的临床意义

2.4.1 MVD与生存状态的关系 存活组MVD最小值43，最大值158，平均值79.8947，标准差为25.4418；复发组MVD最小值36，最大值2.6，平均值103.1136，标准差为33.3635，两组差异有统计学意义（F=12.246，P=0.001）。

2.4.2 MVD与生存期的关系 MVD与生存期存在负相关（r=-0.301，P=0.006），MVD 越高，生存期越短。

MVD与淋巴结转移、肿瘤直径、病理类型均无相关性。

2.5 nm23-H1在乳腺组织中的表达及其生物学意义

2.5.1 nm23-H1蛋白在乳腺组织内的表达 nm23-H1蛋白在良性乳腺病变内呈强表达，在乳腺癌组织中表达下降，在无淋巴结转移的癌组织可见强表达，尤其是在转移或复发病灶甚至无表达。

2.5.2 nm23-H1蛋白表达与淋巴结转移的关系 nm23-H1低表达组淋巴结转移率为83.3%（25/30），高表达组淋巴结转移率为54.5%（24/44），nm23-H1蛋白表达水平与淋巴结转移呈负相关。

2.5.3 nm23-H1蛋白表达与生存状态的关系 nm23-H1低表达组复发率为76.7%（23/30），高表达组复发率为40.9%（18/44）， 低表达组复发率高于高表达组。nm23-H1蛋白表达水平与复发呈负相关。

2.5.4 nm23-H1蛋白表达与生存期的关系 nm23-H1高表达

者存活时间长，低表达者存活时间短，nm23-H1蛋白表达与生存期呈正相关。

2.5.5 nm23-H1和肿瘤实质内Ca-D的关系 本实验发现nm23-H1和肿瘤实质内Ca-D的表达存在相关性，两者同时低表达者占12.5%（9/72），同时高表达者占47.2%（34/72），两者呈正相关（r=0.264，P=0.025），目前尚未见该方面报道。

3 讨论

3.1 E-钙黏附蛋白和微血管密度与乳腺癌患者预后的关系

E-钙黏附蛋白是一类介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，对维护上皮细胞的形态和结构完整性起着重要作用。E-Ca表达下降或缺失，细胞间的相互粘附力下降，造成细胞容易分散而向外浸润性生长，一旦获得转移的条件，就可以脱离原发灶而发生转移[1]。乳腺癌患者的E-Ca的丧失与肿瘤的浸润性、低分化和预后差有关[2-3]。研究发现，将E-Ca的cDNA转染具有浸润性的恶性肿瘤细胞株，则可抑制后者的移动。

本组资料未发现E-Ca与患者淋巴结转移及远期预后的相关性，笔者认为E-Ca作为预测指标不理想。但其在浸润性导管癌和小叶癌中的表达阳性率不同，可以在肿瘤分化比较差的情况下辅助鉴别诊断。

肿瘤的生长和转移是一个依赖血管的过程。乳腺癌是典型的血管依赖性肿瘤。当肿瘤体积超过1 ～ 2 mm3时，维持其继续生长有赖于新生血管的生成。研究发现，随着肿瘤微血管密度的增加，肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增加。Narita等[4]对100例乳腺癌患者进行多因素研究，分析其年龄、肿瘤大小、淋巴结受累状况、雌激素受体、微血管、P53等9个因素与预后的关系，结果提示MVD在淋巴结阴性组中可独立作为预后指标，但在淋巴结阳性组MVD与术后生存期无关。在无复发组中，MVD高低与淋巴结阳性和阴性患者术后长期生存都有良好的相关性。

本组实验结果显示MVD与生存状态及生存期有关，MVD高患者容易出现复发和（或）转移，生存期缩短。肿瘤组织内MVD可作为一种新的反映肿瘤微血管形成强度与侵袭性必然联系的生物学指标，作为肿瘤转移的预报因子，判断预后。

本实验还发现MVD的高低与E-Ca的表达有相关性，E-Ca蛋白表达降低，MVD增高，可能是由于细胞之间黏附性降低，新生血管容易长入的缘故。

3.2 组织蛋白酶D和nm23-H1

Ca-D是一种含天冬氨酸的蛋白酶，正常情况下存在于细胞溶酶体内，由雌激素诱导产生，具有直接消化细胞外间质或间接破坏基底膜的作用，也可发挥生长因子的作用。在蛋白质分解代谢和组织修复过程中可有少量分泌。临床研究发现细胞生长失控时Ca-D分泌增加。这种异常分泌的蛋白酶是细胞内蛋白质衰老退化从而导致癌细胞浸润和扩散的主要原因。

很多临床研究者认为Ca-D可以独立作为预后值[5-6]，在淋巴结阴性的患者组中肿瘤间质内Ca-D呈中等至强阳性时，瘤细胞核分裂数目较高，组织学分级低，无病期及总生存期短[7]。肿瘤浸润性越强，间质反应越明显，瘤细胞分泌生长因子刺激间质细胞表达Ca-D，降解结缔组织，有利于肿瘤浸润和转移，但相反的意见认为，在肿瘤细胞不表达或弱表达、在间质中高表达可能提示预后较好[8]。

本组数据显示组织蛋白酶D表达存在异质性，只有间质细胞Ca-D表达与淋巴结转移、复发、生存期有关，高表达者淋巴结转移率高、容易复发、生存期缩短。

nm23-H1是一种与恶性肿瘤转移相关的基因，多数研究结果表明乳腺癌组织中nm23-H1基因蛋白表达水平降低将增加肿瘤细胞的转移能力。本研究结果表明，59.5%的乳腺癌组织中nm23-H1基因表达较高，与国外文献报道相近。nm23-H1基因低表达组患者的淋巴结转移率为83.33%，复发率为76.67%，明显高于nm23-H1蛋白高表达组（分别为54.55%和40.91%），nm23-H1蛋白表达水平与淋巴结转移及肿瘤复发呈负相关，与生存期呈正相关[9-10]，而与患者的发病年龄、组织学分类、肿瘤大小无关。因此检测nm23-H1基因表达可作为临床预测乳腺癌淋巴结转移趋势的重要参考指标之一[11]。

笔者还发现，肿瘤细胞Ca-D与nm23-H1蛋白表达水平呈正相关，支持肿瘤间质内Ca-D表达增高作为预后不良的判断指标。

肿瘤细胞的浸润和转移是一个涉及多步骤、多因素的复杂过程，通过本研究笔者认为在乳腺癌细胞浸润、转移过程中，E-钙黏附蛋白表达下降，细胞之间的黏附性、间质内微血管密度增高。这些新生血管把肿瘤细胞和循环系统直接连接起来，使肿瘤细胞赖以生长的物质交换得以进行。此外新生血管还可以作为肿瘤转移的通道，通过新生血管将原发癌细胞输送到转移靶器官。肿瘤细胞nm23-H1表达减弱，组织蛋白酶D分泌减弱，可能诱导间质细胞Ca-D合成增多，降解结缔组织，有利于肿瘤浸润和转移。利用乳腺癌患者手术切除标本进行免疫组化标记nm23-H1、MVD和Ca-D有助于预后的判断。

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