拉曼光谱在兽药打假中的应用前景

邵德佳，周 杨，宋慧敏，汪云花，熊 玥，董晶晶，戚雪勇

(1.江苏省兽药饲料质量检验所，南京 210036;2.江苏大学药学院，江苏镇江 212013)

国内市场制售假劣兽药的现象时有发生，在兽药抽检现场，执法人员希望有一种技术方法能够面对林林总总的兽药进行逐一筛查，尽最大可能地抽取假冒伪劣兽药。但目前假劣兽药的识别通常使用化学反应、薄层色谱、仪器分析等方法，耗时耗力，不利于现场识别。近年来快速发展的拉曼光谱具有快速准确、样品用量小、无需前处理等优点，可用于执法现场的兽药筛查，必将成为识别假兽药的重要手段。

1 拉曼光谱

1928年印度科学家拉曼在实验中发现，当一束单色光照射在某些物质上时，会产生一些不同于原单色光、非常微弱的散射光。这部分散射光的波长与原激发光的波长总是相差一个恒定的数量。这一发现在当时立刻引起了轰动，并被英国皇家学会称为“20年代实验物理学中最杰出的发现之一”，这种散射后频率发生变化的现象称为拉曼效应［1］。由于拉曼散射光非常微弱，很难被检测到，导致拉曼光谱技术的发展非常缓慢。直到20世纪90年代，随着光纤样品探头、组合光学设计、计算机以及数据获取、处理、分析等技术的发展，解决了仪器的一些局限，从而使拉曼光谱仪的性能得到很大提高，使其更具有实际应用的价值［2］。从此，拉曼技术开始走出实验室，进入生物化学、安检安防、考古勘探、精密加工、珠宝文物鉴定、化妆品鉴定、医药检测等众多领域。USP28版收录了拉曼分光光度法，用于盐酸林可霉素胶囊溶出度的测定，《中国药典》2010版二部附录XIXL增加了拉曼光谱法指导原则，鼓励各方加强拉曼光谱在药品领域应用的研究［3］。

拉曼光谱法是研究化合物分子受光照射后所产生的散射光与入射光能量差与化合物振动频率、转动频率间关系的分析方法。拉曼光谱与红外光谱类似，是一种振动光谱技术。所不同的是，红外与分子振动时偶极矩变化相关，而拉曼效应则是分子极化率改变的结果，被测量的是非弹性的散射辐射。拉曼光谱与红外吸收光谱相似，是用散射强度对拉曼位移作图，拉曼位移(以cm-1为单位)为激发光的波数与散射辐射的波数之差。由于功能团或化学键的拉曼位移与它们在红外光谱中吸收波数相一致，所以谱图的解析也与红外吸收光谱相同。然而，通常在拉曼光谱中出现的强谱带在红外光谱中却成为弱谱带，甚至不出现，反之亦然，所以，这两种光谱技术常互为补充［3］。有文献报道，利用拉曼光谱和红外光谱同时测定来验证恩诺沙星固体分散体［4］。

2 拉曼光谱仪

拉曼光谱仪使用简单，分析速度快，性能可靠，与其他分析技术联用比其他光谱联用技术从某种意义上说更加简便。根据获得光谱的方式，拉曼光谱仪可分为FT拉曼光谱仪和色散型拉曼光谱仪，所有的现代拉曼光谱仪均包括激光光源、样品装置、滤光系统、光波处理系统(单色器或干涉仪)和检测器等［3］。

从形式上分，目前使用较多的为便携式拉曼光谱仪和显微拉曼光谱仪。便携式拉曼光谱仪体积小，携带方便，但灵敏度不够高，可用于较高浓度的药物测量。显微拉曼光谱仪价格较贵，灵敏度高。在检测方式上，便携式拉曼光谱可将探头直接对准样品进行检测，显微拉曼光谱将样品放在载玻片上，将激光通过物镜聚集到样品测试点上进行检测，两者样品皆不需进行复杂的前处理，检测时方便快捷。

3 在药物分析领域的应用

拉曼光谱多用于鉴别试验，它具有快速、准确的优点，在测量时样品不需要进行前处理或简单前处理即可，可用于固体、半固体、液体、气体的测量，甚至可以通过玻璃、药品的泡罩等对样品进行测量，方便快捷。拉曼光谱谱带尖锐，特征峰明显，使用内标方法还可以进行含量测定。总的来说，拉曼光谱在药物方面的应用还处于探索初期。

3.1 化学药品鉴别中的应用 拉曼光谱仪具有快速、简便、准确率高、无损测量及识别自动化等优点，有望成为药品日常监督中一种有效的鉴别手段。刘朝霞［5］等测定磺胺类药物的拉曼光谱，通过图谱比对进行识别，可准确识别制剂中主成分。张启明［6］等收集解热镇痛类药品26种，其中符合测定要求的有22种，18种成功识别出主成分，识别率为82%;未识别出主成分的药品占18%。造成无法识别出主成分的情况，一方面取决于制剂本身，如颜色、主成分含量及辅料等;另一方面是受仪器性能及识别软件的制约，需要在仪器分辨率、减少荧光干扰及识别算法上作一些改进。

范贤松等［7］隔着药片泡罩鉴定多潘立酮片的真伪，共测试了14个样品，迅速地区分了5个批号的多潘立酮片真药和9个批号的多潘立酮片假药，准确率 100%。头孢菌素类药品［8］、降糖类药物［9］、甲硝唑［10］和万艾可［11］等药物的定性分析的研究亦有报道。

3.2 中药鉴别中的应用 当采集药物的相同部位时，由于一般同一类药用植物它们的红外光谱整体峰形上较为相似，至少同科植物更因代谢途径相似，其主体化学成分的结构相似，便体现出该科的整体特征。五加科和桔梗科皆富含皂甙，五加科的C-O伸缩振动在1 021 cm-1，而桔梗科位于1 031 cm-1以上。谱图间相关系数较好的往往具有科属关系，因此可以此作为判断的指标［12］。类似地采用拉曼光谱法也可以辨别23种常用的植物生药材，包括根、根茎类17种，种子类1种，皮类2种，果实类1种，藻菌地衣类2种［13］。

陈伟炜等［14］对白术煎剂进行了表面增强拉曼光谱的研究，采用银溶胶与白术煎剂相结合，极大地增强了白术煎剂的拉曼信号。与普通的白术煎剂拉曼光谱相比，拉曼散射光谱信号明显增强，尤其在396、548、617、730、955、1 327 cm-1出现了6 个明显的拉曼信号。表面增强拉曼光谱有望为白术煎剂的检测提供一种直接、快速、准确的新方法。

曲晓波等［15］采用拉曼光谱对人参皂苷Rg3两种异构体20-(R)-Rg3和20-(S)-Rg3进行了测量和分析。从拉曼光谱图中可以得知，1674、772、640 cm-1等拉曼振动峰在人参皂苷20-(R)-Rg3和20-(S)-Rg3中有明显的差异。该研究说明，应用拉曼光谱技术可以快速、简便地鉴别出人参皂苷Rg3的异构体。张进治等［16］采用薄层色谱(TLC)与傅里叶变换表面增强拉曼散射(FTSERS)联用对吴茱萸中的6种生物碱进行分析，采用TLC分离出吴茱萸中的6种生物碱，因各生物碱的结构不同，它们的TLC-FT-SERS谱存在明显差异，可以明显地观察到各自的特征峰，从而一一鉴别出来。

林文硕等［17］构建了近红外拉曼光谱探测系统，测试获得了山药的拉曼光谱及拉曼一阶导数谱。山药拉曼光谱中出现了477、863、936 cm-1等较强的特征峰，主要归属为蛋白质、氨基酸、淀粉、多糖等物质，与已知山药生化成分基本相符。山药拉曼一阶导数谱变化较为明显，可以更为清晰地表现山药拉曼光谱，可以作为山药拉曼光谱分析的补充方法。林文硕还测试分析了赤芍、地榆等中药的拉曼光谱以及上述中药的拉曼一阶导数谱。通过各单味中药拉曼光谱分析，确认其归属与已有的相应化学成分基本相符。研究表明，与已有的中药鉴定方法相比，激光拉曼光谱技术可为中药质量监控提供更准确、直接、有效的方法。

周殿凤［18］认为，中药注射剂中的水溶液相对拉曼光谱几乎是透明的，是理想的中药注射剂成分检测工具。虽然不一定能根据图谱的特征谱带直接分析出中药注射剂的各种成分，但可以根据图谱辨别出是某一种中药注射剂。图谱特征峰的相对强度和波数位置造成的细微差异，形成该中药注射剂的系列光谱，分析其中的变化规律，就可以达到分类鉴别的目的。他采用拉曼光谱检测了中药灯盏花素注射剂和红花注射液，均发现了几个特征峰，结果表明拉曼光谱在中药注射剂中的应用是可行的。

3.3 制剂及过程分析中的应用 利用拉曼光谱测定完整片剂的抗压强度具有非侵袭性、快速的特点。Virtanen等［19］测定了各完整片剂的拉曼光谱，同时使用硬度测试仪对各个片剂抗压强度值进行测定，以偏最小二乘回归模型建立了抗压强度与拉曼光谱的相关性。曹玲等［20］对常用羧酸类及其衍生物药用辅料拉曼光谱峰进行指认，分析比较了结构和光谱差异之间的关系，并与红外光谱相互补充佐证，建立了快速、简便、专属性强的鉴别方法。

拉曼光谱固有的高化学特异性和非破坏性，使其作为一个过程分析技术(PAT)工具在生产线应用上有着重大前景［21-24］，但目前国内尚无研究报道。

3.4 晶型研究中的应用 Heinz等［25］通过拉曼定量分析三种不同固态形式(α、γ和无定形)吲哚美辛的混合物。多变量模型(用偏最小二乘回归构建定量模型)相结合的光谱技术非常适合快速量化结晶和无定形吲哚美辛混合物。对一些荧光检测受到限制的，拉曼光谱仍可用于定量分析粉末混合物。Kachrimanis等［26］通过 FT-拉曼光谱和偏最小二乘回归定量分析对乙酰氨基酚多晶型粉末的混合物，在FT-拉曼光谱和PLS-regression基础上，一种简单快速的用于定量分析单斜晶系和正交晶系乙酰氨基酚的方法得到发展。三种不同的预处理算法，即正交信号校正(OSC)、标准正常变量转换(SNV)和多元散射校正(MSC)，分别适用于消除样品制备和样品不均匀性造成的影响。此外，还有盐酸林可霉素、法莫替丁［27］和磺胺噻唑多晶型［28］的研究。

3.5 定量分析中的应用 王玮等［29］分别以拉曼峰的相对峰强和峰面积比值作为参量，以不同采收时期和不同产地的连翘叶为对象，采用内标(甲醇)法进行连翘苷的含量测定。无论以相对峰强，还是以峰面积比值作为参量，都可以用于拉曼光谱定量分析，2种参量的测定结果基本一致。拉曼光谱用于连翘苷的定量分析具有操作简便、迅速等优点，可以用于中草药的含量测定。

吴捷等［30-32］利用SERS表面增强拉曼光谱技术对维生素M、维生素C和维生素B1在银胶颗粒表面吸附行为进行了研究，为维生素进行痕量检测提供重要的参考信息。

Koleva等［33］建立了拉曼光谱测定固体二元混合物中头孢菌素类药物(头孢氨苄、头孢噻吩、头孢来星和头孢孟多酯钠)含量的方法，并且用HPLCMS/MS对结果进行了验证，已成功地应用于10种市售产品片剂的测定。Mazurek等［34］建立了FT-拉曼光谱定量测定片剂和胶囊剂中双氯芬酸钠含量的方法，方法快速、简便，有望替代药典收载的测定固体剂型中双氯芬酸钠含量的方法。Mazurek等［35］利用拉曼光谱定量分析片剂中阿托伐他汀钙的含量。

4 拉曼光谱在兽药打假中的应用前景

拉曼光谱是一门新兴的检测技术，从其在药物分析领域的应用可以看出，目前关于它在药物方面的检测研究还不多，主要用于定性检测研究，定量检测研究较少。在兽药上几乎没有研究［4，36］，在兽药执法现场，可以利用其定性检测，对样品进行筛查。

使用拉曼光谱检测样品，在原料药的检测上，根据图谱可以直接判断出该物质是何种物质，可直接用于原料药的鉴别或原料中间体的控制等。在制剂的检测上，可以根据特征峰进行药品的筛选，如果该制剂没有该样品的特征峰，即为可疑样品，再按法定方法进行确认。

拉曼光谱用于兽药真伪的筛选，具有以下特性:

一是先进性。目前兽药上尚无简单的快速筛选方法，执法人员在兽药检查现场，只能凭标签、说明书、批准文号、外观等进行主观判断。如果使用拉曼光谱，可以利用科学的检测数据进行初筛，减少主观判断的误差。

二是可行性。拉曼光谱仪体积小，尤其是便携式拉曼光谱仪，便于携带，可用于现场使用，检测时操作简单，样品需要量小，且无需进行前处理即可直接检测，检测时间一般是几秒到几十秒，检测速度快，可现场出结果。而其他一些药品的鉴别方法，如化学鉴别、薄层鉴别、仪器鉴别等，不仅需要固定的检测场所，样品需要前处理，检测时间也较长，不具有现场筛选的可能性。

三是实用性。使用拉曼光谱检测时，可透过玻璃、铝塑或药品的泡罩进行测量，对样品无破坏性，操作简单，检测人员稍加培训即可操作。从实验结果看，检测时识别准确率高，无被测样品的特征峰时，即可作为怀疑对象进行进一步的检测。对于目前市场上很多企业随意改变处方、任意添加其他药物的行为，一直没有实用的检测方法。如果建立了制剂的图谱库，通过拉曼光谱图谱，可以清楚地看出哪些企业改变了处方，哪些企业添加了其他的药物成分。

目前将拉曼光谱用于兽药打假还有很多工作要做。首先，拉曼光谱是一门新兴的检测技术，对它的研究还不够，在兽药上的研究几乎为零。拉曼光谱检测时需要标准图谱作为对照，如果将所有药物及其制剂都制作拉曼图谱，无疑将是一个巨大的工程，目前可以循序渐进，从常用兽药开始，逐步完善拉曼光谱图谱库;其次，目前拉曼光谱仪价格还较贵，随着研究的深入、使用的推广，仪器的价格必将逐步下降。

总的来说，拉曼光谱的应用前景是光明的。由于目前对拉曼光谱的研究较少，拉曼光谱走向全面应用还需假以时日，相信随着研究的深入以及检测技术的发展，拉曼光谱在未来兽药的打假过程中必将发挥重要的作用。

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