三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

陈仕龙，陈少莺，江 斌，林锋强，朱小丽，王 劭，程晓霞，黄梅清，李兆龙，郑 敏

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013）

猪繁殖与呼吸综合征（俗称猪蓝耳病）(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以成年母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要症状的猪传染病。PRRSV分为美洲型和欧洲型两个基因型[1,2]。1996年以来，中国流行的是美洲型PRRSV[3]。2006年以来流行于中国的猪高热病，是由美洲型PRRSV变异株引起的一种急性高致死性疫病，对各日龄猪均敏感，主要表现为猪高热(41℃以上)、高发病率、高死亡率、低治愈率。

美洲型传统毒株和变异株鉴别诊断方法有RTPCR、荧光定量PCR及免疫荧光等方法。本文在建立间接免疫荧光（indirect fluorescent antibody test,IFA）鉴别诊断方法的基础上[4]，研制出免疫荧光鉴别诊断试剂盒。为了验证该免疫荧光诊断试剂盒的准确性、敏感性和实用性，本研究对临床送检的疑似病例及人工感染病料进行了RT-PCR、直接免疫荧光检测及病毒分离3种方法的检测，以期对各种诊断方法进行综合评价，旨在筛选出能适合各类型PRRS诊断的实用方法。

1 材料与方法

1.1 病料采集及处理 来源于福建省福清、长乐、南平等地区疑似PRRS病例87份。无菌采集病死猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏等组织和，剪碎研磨，以Hank’s液制成1:5匀浆，加双抗各1000 U，4℃过夜，冻融3次，1600×g离心20 min，取上清液用于病毒分离及RT-PCR检测。采集疑似PRRS病料的肺脏和肺门淋巴结，制备冰冻切片，用于DFA检测。

1.2 试剂及毒株 美洲型PRRSV传统毒株和变异株免疫荧光鉴别诊断试剂盒由本试验室制备，主要包括只能识别传统美洲型PRRSV 的荧光单抗A61及既能识别传统美洲型又能识别变异型PRRSV的荧光单抗C65；RT-PCR鉴别诊断试剂盒购自北京博德安晟商贸发展有限公司；传统美洲型毒株PRRSV-FZ及美洲型变异株PRRSV-FJ0605由本实验室分离、鉴定、保存。

1.3 病料的直接免疫荧光检测(direct immunof l uorescence assay, DFA)检测 取病料的冰冻切片，按本试验室制备免疫荧光鉴别诊断试剂盒的方法进行DFA检测，即切片加入1%BSA-PBS稀释的A61/C65荧光单抗，37℃作用30 min后，用PBS充分洗涤，甘油-PBS封片后镜检观察。若A61、C65荧光单抗加样组都为阳性反应，则为美洲型PRRSV传统毒株感染；若仅有C65荧光单抗组为阳性反应，则为美洲型PRRSV变异株感染；若A61荧光单抗为阳性反应，而C65荧光单抗为阴性，则结果无效。

1.4 病料的RT-PCR检测 取病料匀浆按常规方法提取病毒核酸，按照试剂盒的说明进行RT-PCR试验，扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，出现511 bp特异性条带的为传统美洲型PRRSV毒株感染，扩增出421 bp特异性条带的为美洲型PRRSV变异株感染，并将扩增产物送大连宝生物工程有限公司测序验证。

1.5 病毒分离（virus isolation, VI） 取 DFA及RT-PCR检测均为变异型PRRS的阳性病料5份，DFA及RT-PCR检测均为传统型PRRS的阳性病料5份，DFA及RT-PCR检测均为阴性的病料5份在Marc145细胞单层中进行病毒分离。当出现细胞病变或盲传3代时用RT-PCR鉴别诊断试剂盒进行验证。

1.6 PRRSV人工感染猪及病料的采集 选取28日龄、PRRSV抗体阴性健康仔猪12头，随机分成3组，4头/组。第一组用美洲型变异株PRRSV-FJ0605第7代病毒培养物（104.0TCID50/mL）经滴鼻、肌注途径接种，剂量为2 mL/头；第二组用传统美洲株PRRSV-FZ（104.5TCID50/mL）经滴鼻、肌注途径接种，剂量为2 mL/头；第三组为未攻毒健康对照猪。三组隔离饲养，每日观察临床反应、测定直肠体温。于病毒接种后d 8每组剖杀2头，d 14剖杀2头，采集肺脏、肺门淋巴结等脏器，制作冰冻切片和组织匀浆，用于病毒分离、免疫荧光检测、RT-PCR检测。

2 结果与讨论

2.1 疑似病料的DFA检测 采用实验室试制的PRRS DFA鉴别诊断试剂盒对临床疑似PRRS疫情的87份病料进行检测，PRRS总阳性数37份，阳性率为43%；其中变异型PRRS有24份，占PRRS阳性率的65%，传统美洲型PRRS 13份，占PRRS阳性率的35%；50份样品检测为阴性。淋巴节及肺脏切片的阳性荧光反应见图1 A-D。

图1 淋巴节及肺脏切片的阳性荧光反应（200×）Fig.1 The positive reaction of Lymph node and lung by DFA (200×)

2.2 疑似病料的RT-PCR检测及与DFA的符合率比较 采用RT-PCR鉴别诊断试剂盒对87份疑似病料进行平行检测，结果PRRSV总阳性数为39份，阳性率为45%；其中变异型PRRSV有24份，占PRRS阳性率的62%，传统美洲型PRRS 15份，占PRRS阳性率的38%；48份样品检测为阴性。经过对扩增产物的测序验证，凡是扩增出421bp特异性条带的毒株在Nsp2区域有两处基因，共缺失30个氨基酸，符合美洲型PRRSV变异株的特征；凡是扩增出511 bp片段的毒株，在Nsp2区域不存在缺失，符合传统PRRSV毒株的特征。DFA与RTPCR检测变异性PRRS的符合率为100%，DFA与RT-PCR检测传统型PRRS的阳性符合率为87%（13/15），DFA与RT-PCR的阴性符合率为96%（48/50），DFA与RT-PCR检测临床疑似病料的总符合率为94.3%。

2.3 临床确诊病料的病毒分离 结果5份变异型PRRS病料病毒分离均为阳性；5份传统型PRRS病料，只有4份病毒分离为阳性；5份PRRS阴性病料病毒分离都为阴性。

2.4 PRRSV人工感染猪的临床表现 PRRSVFJ0605接种后2～3d，仔猪开始陆续发热，直肠温度达40.5℃～42.5℃，持续高热9～12 d。病程前期临床表现为：食欲不振、精神沉郁、眼睑水肿、皮肤充血、严重的呼吸困难，病猪濒死。PRRSV-FZ组感染组病情较轻，体温略升高（39.3℃～40.6℃），仔猪咳嗽、采食减少，未见死亡；阴性对照猪在观察期间未见异常。

图2 传统美洲型和变异型PRRSV毒株的RT-PCR鉴定图Fig.2 PRRSV’s identif i cation by RT-PCR differential diagnosis kit

2.5 人工感染猪DFA、RT-PCR及VI三种方法的平行检测 分别采集每头攻毒猪的肺脏、淋巴结、肾脏等组织，制成匀浆在Marc145细胞中进行病毒分离，待出现细胞病变时，用PRRSV单抗进行免疫荧光验证；取攻毒猪内脏匀浆，提取核酸，按照PRRSV RT-PCR鉴别诊断试剂盒进行检测；取攻毒猪肺脏及肺门淋巴结，制备冰冻切片，用于DFA检测。结果，变异株攻毒组4头猪病毒分离、DFA和RT-PCR检测均为阳性。传统美洲株攻毒组4头猪RT-PCR均为阳性，而VI及DFA检测均是3头阳性。

2.6 人工感染和确诊病料DFA检测与VI及RTPCR检测的符合率比较 本研究共对12份人工感染病料及15份临床确诊病料进行了DFA与VI及RT-PCR的符合率统计，见表1。变异型PRRS 9份，病毒分离、RT-PCR和DFA检测均为阳性。传统型PRRS 9份，病毒分离阳性数7份，阴性2份；DFA检测阳性数8份，阴性1份；RT-PCR检测都是阳性。9份阴性病料三种方法检测都是阴性。DFA与VI的阳性符合率为94%（16/17），阴性符合率为91%（10/11），DFA与VI的总符合率为92.5%。DFA与RT-PCR之间的阳性符合率为94%（17/18），阴性符合率为90%（9/10），DFA与RT-PCR之间的总符合率为92.2%。

表1 三种方法对12份人工感染和15份确诊病料检测结果的比较Table 1 The comparison of three diagnostic methods for detecting classical PRRSV and variant PRRSV

2.7 本研究用自己研制PRRS鉴别诊断DFA试剂盒、RT-PCR鉴别诊断试剂盒及VI 3种诊断方法对临床疑似病例及人工感染病料进行检测，并进行符合率比较，以期为我国正流行的传统美洲型PRRS和变异型PRRS的鉴别诊断提供理论依据。结果，RTPCR敏感性最强，DFA次之，VI最差。DFA免疫荧光诊断法与病毒分离的符合率达92.5%，与商品化的RT-PCR诊断试剂盒之间的符合率为92.2%。说明我们研制的DFA诊断试剂盒试验结果可靠，敏感性强，可用于临床各类型PRRS的确诊。

本研究应用3种方法对疑似病例及人工感染病料检测发现，变异型PRRSV毒株比传统PRRSV毒株更易病毒分离成功。我们对人工感染病例各器官检测也发现，变异型PRRSV广泛分布于各个器官，而传统美洲型PRRSV毒株则主要分布在肺脏、淋巴结等器官。这在一定程度上解释了PRRSV变异株的致病性、传染性高于传统美洲型PRRS的原因。

要从根本上预防和消灭PRRSV，研制快速、简便且适于基层推广应用的诊断试剂具有重要的社会意义。传统PRRSV和变异型PRRSV鉴别诊断的RT-PCR 试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒，具有敏感性强、检测时间较短(5～10 h 得出结果) 等优点，但试验成本较高，操作繁琐、需要较多的仪器设备，不适合兽医临床和基层对PRRS的快速诊断，且核酸样品容易交叉污染，出现假阴性，造成阴性检查出率过高的现象。病毒分离是诊断病毒性疾病的金标准，特异性强，常用于新诊断试剂的评价；但耗时长，敏感性不高，成本和技术要求高，且阳性分离物还需要借助其它方法进行验证，一般适用于技术和设备较好的科研机构的回顾性诊断[5]。本项目组研制的鉴别传统美洲型PRRSV和变异型PRRSV的DFA试剂盒简便、快速、特异性强、成本低，适用于各类PRRS疫情的快速诊断、鉴别、流行病学调查等，特别是对采集不及时或死亡时间过长等样品的检测具有较强的优势，弥补了RT-PCR、VI等检测方法过程复杂，费时费力的缺陷。但是该DFA试剂盒需配备荧光显微镜、冰冻切片机，操作人员要有一定的经验，样品处理方法为冰冻切片，不适宜做活体检测，限制其进一步的推广应用。以后应加强该荧光诊断试剂盒在活体或死后组织触片的应用研究，使建立的DFA诊断方法更简单和实用。

[1] 陈仕龙, 林天龙, 陈少莺, 等.猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版), 2008, 36(8): 45-50.

[2] 黄梅清, 车勇良, 陈少莺, 等.猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型FJ0602 株的分离及其ORF7 的序列分析[J].中国预防兽医学报, 2008, 30(3): 174-178.

[3]郭宝清, 陈章水, 刘文兴, 等.从疑似PRRS 流产胎儿分离PRRSV 的研究[J].中国畜禽传染病, 1996, 18(2): 124.

[4]陈仕龙, 黄梅清, 林天龙, 等.高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立[J].中国兽医科学, 2009, 39(1): 41-44.

[5]王向鹏, 张兴娟, 孙元, 等.六种检测猪瘟病毒方法的比较[J].微生物学报, 2010, 50(8): 1087-1093.