三种化学物质诱导观赏百合对黑斑病抗性的研究

梁巧兰, 魏列新, 徐秉良*, 师桂英

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,兰州 730070;2.甘肃农业大学农学院,兰州 730000)

三种化学物质诱导观赏百合对黑斑病抗性的研究

梁巧兰1, 魏列新1, 徐秉良1*, 师桂英2

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,兰州 730070;2.甘肃农业大学农学院,兰州 730000)

[目的]确定水杨酸、纳米硅、草酸铵等3种化学物质对观赏百合黑斑病抗病性的诱导效果,为百合生长期病害的防治提供理论依据。[方法]测定3种化学物质对观赏百合黑斑病菌的抑菌活性和诱导寄主抗性效果。[结果]3种化学物质对观赏百合黑斑病菌抑菌率较低,最高仅为5.43%,但处理百合叶片后,诱导百合产生较高抗病性。在100、50 μ g/mL和25μ g/mL浓度下,纳米硅的诱导抗病效果最好,分别为55.55%、60.69%、48.57%。水杨酸诱导处理可使观赏百合叶片β-1,3-葡聚糖酶在第1天达到峰值,纳米硅可以使过氧化物酶在第5天达到峰值,草酸铵可以使苯丙氨酸解氨酶在第5天达到峰值,分别为对照的3.95倍、2.10倍和1.15倍;先诱导处理再接种黑斑病菌1 d后叶片组织内β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性均明显高于对照;水杨酸、纳米硅和草酸铵处理7 d后田间诱导防病效果分别为35.38%、43.55%和 31.07%;处理14 d后,与第7天相比诱导防病效果明显降低。[结论]水杨酸、纳米硅和草酸铵3种化学物质对百合均有一定诱导抗病作用,其中纳米硅酸的诱导抗病效果最好,可达到48%以上。

化学物质; 观赏百合; 黑斑病; 诱导抗性

观赏百合是世界上著名的球根花卉,植株刚直挺秀、清雅脱俗、芳香宜人,是目前国际市场上十分畅销的花卉之一。观赏百合黑斑病发生普遍[1],调查发现田间平均发病率为63.67%。观赏百合黑斑病由半知菌链格孢(Alternaria alternata)引起,在叶片上形成圆形或不规则形褐色病斑,严重时整叶枯死,植株一生均可受害,严重影响植株的光合作用,使其观赏价值降低。

长期以来,生产上主要采用化学药剂进行防治,而化学药剂防治存在农药残留、污染等问题,使切花的价值降低,同时影响人类健康。而诱导抗病性是指植物在各种诱导因子的作用下,使植物体内与抗病有关的基因得到表达,从而产生抗病性,即系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)[2-5]。目前,植物诱导抗病性为植物病害的防治开辟了一条新途径。利用化学诱抗剂水杨酸、纳米硅、草酸钾诱导植物抗病性已有报道[6-7]。本试验选用水杨酸、纳米硅、草酸铵这3种化学物质对观赏百合黑斑病诱导抗性进行了研究,旨在确定这3种化学物质对观赏百合黑斑病抗病性的诱导效果,为百合生长期病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌种

观赏百合黑斑病菌(Alternaria alternata)由甘肃农业大学农药实验室从田间发病的叶片分离、纯化、鉴定并保存在 PDA斜面培养基上,4℃贮存备用。

1.1.2 供试材料

水杨酸(SA)(天津光复精细化工研究所,含量99%)、纳米硅(舟山明日纳米材料有限公司生产,化学纯,平均粒径为15 nm,比表面积160 m2/g)、草酸铵(天津光复精细化工研究所,含量99%);观赏百合,品种为‘西伯利亚’。

1.2 3种化学物质对观赏百合黑斑病菌抑菌活性测定

将水杨酸、纳米硅、草酸铵用灭菌水分别配制成100 μ g/mL ×50 倍 、50 μ g/mL ×50 倍 、25 μ g/mL×50倍3个浓度,在无菌条件下取1 mL不同浓度的药液加入49 mL PDA培养基中摇匀后倒入4个培养皿中,以灭菌水作对照,做好标记;在无菌操作条件下将经过PDA活化培养4 d的百合叶斑病菌用灭过菌的打孔器沿菌落边缘制成菌饼,并将菌饼接种于冷却后的含药PDA上,在24℃恒温箱内培养96 h后,用十字交叉法测定菌落的直径,并按下式计算不同化学物质的抑菌率。

1.3 3种化学物质对观赏百合诱导抗病性测定

用上述不同浓度水杨酸、纳米硅、草酸铵喷雾处理现蕾期观赏百合健康叶片,3 d后采用喷雾法接种浓度为1×104个/mL供试链格孢,用清水作对照,每个浓度处理3株,重复3次;然后24℃保湿培养,接种一周后根据以下症状分级标准(参考农药田间药效试验准则,略有修改)[8]调查发病情况,并按以下公式计算病情指数和诱导抗病效果。

百合黑斑病症状分级标准:0级,无症状;1级,病斑占叶面积25%;2级,病斑病斑占叶面积26%～50%;3级,病斑占叶面积51%～75%;4级,病斑占叶面积76%～100%。

1.4 3种化学物质对观赏百合病程相关蛋白活性的影响

1.4.1 试验方法

用50 μ g/mL的水杨酸、纳米硅和草酸铵以叶面喷雾的方式处理百合植株,以清水为对照,每种物质处理6株,每处理重复2次,3 d后将经过化学物质和清水处理的百合植株分成两组,其中一组采用喷雾法接种浓度为1×104个/mL供试链格孢,另一组喷施清水,24℃下保湿培养,然后分别于化学物质处理后1、3、5、7 d及接种后1 d,采集经处理的观赏百合叶片进行酶活性测定。

1.4.2 酶液的提取、活性的测定及计算

分别参考El Ghaouth[9]和中国科学院上海植物生理研究所[10]的方法对β-1,3-葡聚糖酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)进行提取及酶活性测定。

POD的提取采用袁庆华等[11]方法。POD的测定采用愈创木酚作底物,用分光度法测定生成物的含量,在470 nm波长下测定吸光值。以1 mL去离子水代替H2O2为对照[10]。

在上述反应条件下,以每分钟每克鲜样A值变化1.00所需的酶量为一个酶活单位(U)。各样品均测定2次,3个重复。

1.5 3种化学物质对观赏百合田间诱导防病效果测定

将用3种化学物配成浓度为50 μ g/mL的溶液,喷雾处理田间现蕾期观赏百合,以不同化学物质作为处理,每个处理30株,重复 3次,以清水喷雾为对照。分别于处理前和处理后7、14 d按1.3中分级标准采用5点取样法,每样点10株,随机调查60个叶片,并按下式计算田间发病率、病情指数(同1.3)及诱导防治效果[8]。

2 结果与分析

2.1 3种化学物质对观赏百合黑斑病菌抑菌活性

抑菌活性测定结果表明水杨酸、纳米硅和草酸铵对观赏百合黑斑病菌的抑制作用较低,当浓度为100 μ g/mL时3种化学物质的抑菌率最高,分别为1.12%、2.47%和5.43%,随着浓度的降低抑菌率逐渐降低,而当草酸铵浓度为25 μ g/mL时,对链格孢不仅无抑菌作用而且表现出刺激生长作用(表1)。

2.2 3种化学物质诱导观赏百合抗黑斑病效果

诱导抗病性试验结果表明,不同处理的观赏百合黑斑病发生情况不同。经DPS3.0软件 LSD方差分析结果表明,同一化学物质不同浓度处理的病情指数和对照的病情指数之间均存在显著差异,而且3个浓度处理的病情指数之间也存在显著差异,其中浓度为50 μ g/mL时3种化学物质处理的病情指数均低于其他两个浓度处理的。同一浓度不同化学物质处理的病情指数和对照的病情指数之间均存在显著差异,浓度为100 μ g/mL时,纳米硅处理的病情指数和水杨酸、草酸铵处理的病情指数之间存在显著差异,而水杨酸、草酸铵处理的病情指数之间差异不显著;浓度为50 μ g/mL时,3种化学物质处理的病情指数之间也存在显著差异;浓度为25 μ g/mL时,水杨酸处理的病情指数和纳米硅、草酸铵2种化学物质处理的病情指数之间存在显著差异,而纳米硅、草酸铵2种化学物质处理的病情指数之间差异不显著。统计分析结果表明,所选用的3种化学物质对百合叶片抗链格孢菌均有一定诱导作用,在 3种浓度下纳米硅诱导效果最高,分别为55.55%、60.69%、48.57%;水杨酸的诱导效果与草酸铵的相差不大。浓度为 50 μ g/mL时,水杨酸、纳米硅和草酸铵诱导抗病效果最好,分别为52.41%、60.69%和 57.58%(表1)。

表1 3种化学物质对观赏百合黑斑病菌的诱导抗病效果1)

2.3 3种化学物质对观赏百合病程相关蛋白活性的影响

2.3.1 3种化学物质对β-1,3-葡聚糖酶活性的影响

浓度为50 μ g/mL的3种化学物质诱导处理后,百合叶片组织内β-1,3-葡聚糖酶活性有明显变化(图1)。水杨酸处理后第3天百合叶片中酶活性达最大值,纳米硅和草酸铵处理后第7天百合叶片中酶活性达最大值。分别是对照的2.32、1.23倍和1.61倍;接菌后1 d,诱导处理的酶活性分别是对照的3.95、1.06倍和4.17倍。通过对3种化学物质诱导处理结果比较,发现水杨酸处理观赏百合叶片后,β-1,3-葡聚糖酶活性增加较快,1 d时的酶活性高于对照及其他两个处理。表明水杨酸较易诱导β-1,3葡聚糖酶活性的提高。

图1 3种化学物质对百合叶片β-1,3葡聚糖酶活性影响

2.3.2 3种化学物质对过氧化物酶(POD)活性的影响

经水杨酸、纳米硅和草酸铵诱导处理1 d后、3 d后和接种1 d后,百合叶片组织内POD活性明显高于对照,分别为对照的 1.25、1.13、1.16倍,1.31、1.69 、1.51倍和 1.60、1.46、1.80 倍;纳米硅诱导处理5 d后,百合叶片组织内 POD酶活性达到最大值,为对照的2.10倍,之后酶活性略有下降(图2)。

2.3.3 3种化学物质对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

草酸铵诱导处理后,不同处理时间百合叶片组织内PAL活性呈先升后降的变化趋势(图3),在第5天酶活性达到最大值,为对照的1.15倍,水杨酸、纳米硅处理的酶活性和对照相差不大;接种后1 d水杨酸、纳米硅和草酸铵处理的酶活性均高于对照,分别为对照的1.87、1.64倍和1.76倍(图3)。

2.4 3种化学物质对观赏百合田间诱导防病效果

田间诱导防病效果测定结果表2表明,3种化学物质对观赏百合抗黑斑病均有一定的诱导防治作用,处理后7 d的诱导防病效果均达到30%以上,其中纳米硅的诱导防治效果最好为43.55%,水杨酸次之,草酸铵最低;诱导处理14 d后发病率和病情指数低于处理前而高于处理后7 d的,水杨酸、纳米硅和草酸铵的诱导防病效果分别比处理后7 d的防病效果降低了42.23%、48.57%和39.42%。

表2 3种化学物质对观赏百合黑斑病田间诱导防治效果

3 结论与讨论

水杨酸、纳米硅和草酸铵3种化学物质对百合叶片抗链格孢菌均有一定诱导抗病作用,其中纳米硅的诱导抗病效果最好,可达到48%以上。

有研究表明,β-1,3-葡聚糖多聚体是大多数植物病原真菌细胞壁的主要成分之一,而β-1,3-葡聚糖酶通过催化β-1,3-葡聚糖多聚体的水解,将其降解为葡萄糖,从而抑制真菌的生长及增殖[12];POD是植物体内普遍存在的氧化还原酶,它不仅参与了木质素、酚类物质及植保素的合成,还作为整个代谢途径的调节子,通过影响植物体内多种代谢途径而在抗病性中起作用,是与植物抗病有关的一种重要酶[13-14]。PAL活性与植物抗病性密切相关,其活性可作为衡量植物抗病性的生化指标之一。植物感染病原菌后PAL活性明显升高,并表现出规律性的变化,如张淑珍等在对疫霉根腐病菌毒素胁迫下不同大豆抗感品种PAL活性的研究中发现,抗病大豆品种的根、茎和叶中PAL活性在病程的大部分阶段都高于对照[15],PAL的植物抗病机制主要表现为参与植保素、木质素和酚类物质的合成[16]。由此可见这3种酶活性的提高是植物抗病性增强的具体表现。本试验结果也表明经水杨酸、纳米硅、草酸铵诱导处理后,观赏百合叶片组织内病程相关蛋白酶 β-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL活性均在短时间内提高,表现出规律性变化,且明显高于对照,表明这3种化学物质能够激活观赏百合叶片的防御体系,使百合叶片产生了对叶斑病的抗性;3种化学物质处理后,β-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL变化规律不同,水杨酸处理可使百合叶片中的β-1,3-葡聚糖酶在短时间内达到峰值,纳米硅和草酸铵处理又分别能够使POD和PAL在第5天达到峰值,这表明3种化学物质对观赏百合抗黑斑病的诱导机制可能存在差异,本试验尚未涉及;另外,田间试验结果表明3种化学物质对观赏百合抗黑斑病有一定的诱导防治效果,但随着时间推移诱导防病效果明显降低,对于这3种化学物质的最佳诱导时间、诱导抗病性持效期以及能否诱导观赏百合叶片产生对其他叶部病害的抗性等问题还有待于进一步研究。

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Resistance of ornamental lily against Alternaria alternata induced by threechemicals

Liang Qiaolan1, Wei Liexin1, Xu Bingliang1, Shi Guiying2
(1.College of Grassland Science/Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education/Sino-U.S.Center for Grazingland Ecosystem Sustainability,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China;2.College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China)

chemicals; ornamental lily;Alternaria alternata; induced resistance

S 432.23;S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.007

2010-03-05

2010-03-22

甘肃省农牧厅生物技术专项(GNSW-2009-04,GNSW-2005-14);甘肃省教育厅项目(0702B-01);兰州市科委项目(03-1-39)

*通信作者E-mail:xubl@gsau.edu.cn

[Objective]The induced resistance effect of salicylic acid(SA),nanometer silicon and ammonium oxalate for lily toAlternaria alternatawere evaluated so as to provide the basis for control of lily diseases.[Method]The inhibitory bioactivity and the induced resistance of ornamental lily toA.alternataelicited by three chemicals were tested.[Result]The inhibitory effects of salicylic acid(SA),nanometer silicon and ammonium oxalate toA.alternatawere very weak,and the rates of inhibition were less than 5.43%.When treated at the concentration 100 μ g/mL,50 μ g/mL and 25 μ g/mL of nanometer silicon,the induced resistance to lily leaves reached 55.55%,60.69%and 48.57%,respectively.The enzyme activity of β-1,3-glucosan reached the maximum in one day when lily leaves were treated bySA,while the enzyme activity of POD induced by nanometer silicon and PAL induced by ammonium oxalate reached the maximum in five days,which were 3.95,2.10 and 1.15 times as those of control,respectively.The enzyme activity of β-1,3-glucosan,POD and PAL enzyme of lily leaves were higher than that of the control when lily leaves were treated with 50 μ g/mL of the three chemicals and then inoculated withA.alternata.The induced resistance to lily leaves elicited by the three chemicals after seven days reached 35.38%,43.55%and 31.07%,respectively.After fourteen days,the induced resistance to lily leaves was decreased significantly,compared with that elicited by the three chemicals after seven days.[Conclusion]Salicylic acid(SA),nanometer silicon and ammonium oxalate had induced resistance effects to lily to some extent,among which,nanometer silicon had the best effect of over 48%.