三氯化镧对CBRH-7919细胞CDK4和P21蛋白表达的影响

杨立明 姜文平 姜文华 (吉林大学第一医院肾内科，吉林 长春 300)

肝癌是世界上最常见的肿瘤之一，死亡率居第三，并且其发病率还在逐年上升〔1〕。目前虽然治疗方法很多，但效果都不理想，临床效果差，死亡率高〔2〕。国内外近年的研究表明稀土化合物具有明显的抑瘤性能〔3～5〕。但有关稀土化合物对肝癌细胞周期影响的研究报道非常少见。本实验以稀土化合物在体内外均有明显的抑瘤性能为理论基础，以大鼠肝癌细胞株CBRH-7919为研究对象，探讨稀土化合物三氯化镧(LaCl3)是否能阻抑CBRH-7919细胞的异常调控，从而阻止肿瘤的进一步发展，阻止肿瘤的浸润和转移。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 LaCl3由北京稀土农用中心提供;DMEM培养基、小牛血清、胰酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均为Gibco公司产品;RNA酶、碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品;细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)和P21免疫细胞化学试剂盒为Santa Cruz公司产品，其余试剂为国产分析纯。

1.1.2 细胞株 大鼠肝癌细胞株CBRH-7919，购于中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 分组 实验分为3组;对照组:CBRH-7919培养在含10%小牛血清的DMEM培养液中;实验组分为两组:CBRH-7919细胞分别培养在含0.10和1.00 mmol/L LaCl3的DMEM培养液中。培养时间分别为1、3、5 d。

1.2.2 流式细胞术(FCM) 每组收集细胞5×106个，固定于70%冷乙醇中，4℃过夜。加入0.01%RNA 酶 10 ～15 μl，37℃水浴30 min，加0.25%PI染色剂(避光)染色30 min，作流式细胞仪检测。每组随机检测1×105个细胞，计算各期细胞比例。

1.2.3 MTT实验 CBRH-7919细胞，培养在96孔培养板中(每孔含3×103个细胞)12 h后，分别加入含不同剂量的LaCl3的DMEM培养液。分别培养1、3、5 d。在上述各时间点作用结束前4 h每孔加 MTT(5 g/L)20 μl。培养结束后，每孔加入DMSO 溶液 100 μl，作用 10 min，用酶标仪(波长 570 nm)测定各孔吸光度值(OD值)。

1.2.4 集落形成实验 取对数生长期的CBRH-7919细胞，每瓶100个细胞，培养12 h后，加入前述浓度的LaCl3，每组设6瓶，连续培养9 d。常规固定、苏木精染色后，在显微镜下计数多于50个细胞的克隆数。

1.2.5 免疫细胞化学方法 CDK4和P21均采用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，二氨基联苯胺(DAB)显色。在显微镜下观察并计数1 000个细胞中的阳性细胞数，并计算其阳性率。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照，以确定免疫细胞化学染色的特异性。

1.3 统计学分析 应用SPSS10.0统计软件，OD值、集落形成数量，采用单因素方差分析;G0/G1期、S期比率及CDK4和P21蛋白表达的阳性率进行组间的χ2检验。

2 结果

2.1 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞生长及集落形成的影响 MTT实验结果表明，0.10 mmol/L LaCl3作用3 d即对CBRH-7919细胞生长具有明显的抑制作用;随着LaCl3剂量的增加和作用时间的延长，对CBRH-7919细胞生长的抑制作用也增强。集落形成实验显微镜下观察可见，对照组集落满视野，体积大;0.1 mmol/L LaCl3组集落分布稀疏，体积较小;1 mmol/L LaCl3组集落偶见，体积小。0.1、1 mmol/L LaCl3对CBRH-7919细胞的集落形成具有明显的抑制作用，呈剂量依赖性。见表1。

2.2 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞G0/G1期及S期的影响 流式细胞仪结果可见，CBRH-7919细胞经0.1、1 mmol/L LaCl3作用1、3、5 d后，G0/G1期细胞百分数增加，S期细胞百分数减少，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)。见表2。

2.3 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞CDK4和P21表达的影响 CDK4免疫细胞化学实验结果表明，随着LaCl3剂量与时间的增加，阳性细胞数逐渐减少，着色强度也越来越弱;0.10 mmol/L 和 1.00 mmol/L LaCl3组1、3、5 d CDK4 表达均明显减弱，与对照组相比有非常显著差异(P＜0.01);1.00 mmol/L LaCl35 d组CDK4表达最弱。P21免疫细胞化学实验结果表明，对照组阳性细胞数很少，分布稀疏，染色淡;0.10 mmol/L LaCl3组细胞在培养1、3、5 d后，P21阳性细胞数有所增加，但与对照组比较无显著性差异;而1.00 mmol/L LaCl3组细胞在培养1 d后P21阳性率即呈显著性增加，而且随着培养时间的延长，增加的程度越高。见表3。

表1 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞生长及集落形成的影响(n=6，±s)

表1 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞生长及集落形成的影响(n=6，±s)

与对照组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与同组1 d、3 d比较:3)P ＜0.01;下表同

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表2 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞G0/G1期及S期比率的影响(n=6，± s，%)

表2 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞G0/G1期及S期比率的影响(n=6，± s，%)

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表3 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞CDK4和P21表达阳性率的影响(n=6，± s，%)

表3 不同剂量的LaCl3对CBRH-7919细胞CDK4和P21表达阳性率的影响(n=6，± s，%)

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3 讨论

众多的研究表明细胞周期调节的失控与肿瘤的发生﹑发展具有密切的关系。在细胞周期调控中G1/S的调节尤为重要。细胞一旦从G1期跨入S期，则不再依靠外来信息刺激而自动完成分裂过程。CDK4是细胞周期G1期重要的调控分子，CDK4蛋白能够特异性地与细胞周期素(Cyclin D1)结合形成复合物，使视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白磷酸化，导致转录因子(E2F)的释放，促使细胞完成DNA复制;P21是CDKs家族广谱抑制剂，通过抑制CDK活性，诱导周期阻滞导致细胞分裂增殖停止，从而抑制肿瘤细胞生长，为肿瘤抑制基因〔6～8〕。

稀土化合物对肿瘤相关基因表达的研究较少见，刘玉荣等〔9〕研究表明，0.10、0.50 及1.00 mmol/L LaCl3使 SMMC-7721细胞Cyclin D1、增殖细胞核抗原(PCNA)和CDK4蛋白表达下降，P16蛋白表达上升。在本实验中，0.10及1.00 mmol/L LaCl3对CBRH-7919细胞的生长和集落形成有明显抑制作用 。通过流式细胞仪检测细胞周期各时相变化情况，结果显示0.10、1.00 mmol/L LaCl3均可使G0/G1期细胞百分数显著增加，而S期细胞百分数显著下降，表明CBRH-7919细胞从G1期进入S期受阻，使CBRH-7919停留在G1期。表明LaCl3可通过下调 G1期的 CDK4，重建了 CBRH-7919细胞周期失控的G1→S期检查点，使CBRH-7919细胞从G1期进入S期的过程受阻;而且，LaCl3可刺激 P21的表达，P21表达的增加使CBRH-7919细胞G1→S期的负调控路径恢复，从而使CBRH-7919停留在G1期，流式细胞术的结果也证实了这一点。

综上所述，LaCl3可通过下调CDK4和上调P21的蛋白表达，使CBRH-7919细胞阻滞在G1期，从而抑制CBRH-7919细胞的生长。

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5 Chen Y，Yang L，Feng C，et al.Nano neodymium oxide induces massive vacuolization and autophagic cell death in non-small cell lung cancer NCIH460 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;337(1):52-60.

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8 Yu Q，Sicinska E，Geng Y，et al.Requirement for CDK4 kinase function in breast cancer〔J〕.Cancer Cell，2006;9(1):23-32.

9 刘玉荣，陈 东，姜文华，等.三氯化镧对体外培养人肝癌细胞的抑制作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2006;32(6):1029-33.