白杨素敏化TRAIL诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

任 翔 ，刘 飞 ，韩守恒 ，曹建国

（1.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013；2.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳 421001）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)具有诱导被病毒感染的细胞、恶性转化细胞和肿瘤细胞凋亡而对正常组织及细胞几乎没有毒性作用的特点[1-3]，使其极有可能成为新的抗肿瘤候选药。白杨素 (chrysin,ChR)能抑制包括人胃癌SGC-7901细胞在内的多种人肿瘤细胞系细胞生长[4-5]。Szliszka等[6]最近报道富含ChR的蜂胶乙醇提取物增强TRAIL诱导癌细胞凋亡。本文旨在研究ChR敏化TRAIL诱导SGC-7901细胞凋亡作用。

1 材料和方法

1.1 试剂

ChR和碘化丙啶(PI)为美国Sigma公司产品，TRAIL为英国PeproTech公司产品。

1.2 细胞培养

人胃癌SGC-7901细胞购于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，3 d传代1次。

1.3 流式细胞术分析

参照文献[7]取对数生长期的SGC-7901细胞，用含0.1%的小牛血清的培养基处理24 h进行细胞周期同步化后，分别加入含标示浓度受试物的培养基处理48 h,0.1%DMSO作为溶媒对照。收集所有贴壁细胞和悬浮细胞，用4℃的75%乙醇固定24 h，经碘化丙啶(PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量。

1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳

参照文献[8]取对数生长期SGC-7901细胞，分别加入含标示浓度受试物的培养基处理48 h,培养基作为细胞对照，含0.1%DMSO的培养基作为溶媒对照。收集所有贴壁细胞和悬浮细胞，按北京博大泰克生物基因技术有限公司凋亡细胞DNA ladder检测试剂盒说明书步骤分别提取DNA，置于4℃冰箱过夜。再将提取的DNA样品5 μL与6×Buffer 1 μL混匀后，加到1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，Alphaimager TM 2200凝胶图像分析系统观察并摄影。

1.5 统计学分析

实验数据录入SPSS 15.0 for windows evaluation软件，建立数据库，各组实验数据用mean±SD表示，用行方差分析；对照组均数与实验组均数间的比较用LSD法，P＜0.05为统计学差异。

2 结果

2.1 亚毒性浓度ChR、TRAIL及两者合用对SGC-7901细胞凋亡率的影响

ChR 40 μmol/L或TRAIL 100 ng/mL单独处理SGC-7901细胞48 h，其亚二倍体DNA含量细胞百分率 (凋亡率)分别为 (4.57±0.54)%、(3.70±0.1)%(图1)；说明二者单独作用时，在受试浓度水平，诱导细胞凋亡作用微弱；但是，用40 μmol/L的ChR预孵育30 min，再加入100 ng/mL的TRAIL处理48 h，发生凋亡的SGC-7901细胞显著增加，细胞凋亡率为(48.81±4.11)%(图1)。提示：亚毒性浓度的ChR能有效地增强TRAIL导诱导SGC-7901细胞凋亡。

图1 亚毒性浓度的 ChR、TRAIL及两者合用对SGC-7901细胞凋亡的影响

2.2 亚细胞毒性浓度的ChR、TRAIL及两者合用对SGC-7901细胞DNA断裂的影响

DNA琼脂糖凝胶电泳显示：单用ChR 40 μmol/L或TRAIL 100 ng/mL作用48 h，未见典型DNA 梯形条带(图 2)；但是，用 40 μmol/L的 ChR 预孵育30 min，再加入100 ng/mL的TRAIL处理48 h，展示出典型DNA梯形条带图谱(图2)；证实亚细胞毒性浓度的ChR具有显著增强TRAIL诱导SGC-7901细胞凋亡作用。

图2 亚毒性浓度的ChR、TRAIL及两者合用对SGC-7901细胞DNA断裂的影响(DNA琼脂糖凝胶电泳)

3 讨论

TRAIL相对其家族成员TNF和Fas L而言，其抗瘤谱更广，具有肿瘤细胞特异性毒性，并且其诱导凋亡作用不依赖p53机制，使其有望成为抗肿瘤新候选药物[9]。但随着研究广泛开展，发现多种肿瘤细胞耐受TRAIL诱导凋亡作用。本文单用TRAIL(100 ng/mL)处理SGC-7901细胞，PI染色流式细胞术分析其细胞凋亡率仅为(3.70±0.1)%，同时DNA琼脂糖凝胶电泳检测未见凋亡细胞的典型DNA梯形条带，说明人胃癌SGC-7901细胞对TRAIL耐药。

有研究报道，化疗药物5-氟尿嘧啶、阿霉素、依托泊苷及喜树碱等可显著提高TRAIL诱导多种人肿瘤细胞系凋亡[9]。我们先前的研究证实：ChR及其衍生物可通过激活PPARγ，抑制Bcl-2和NF-kappaB蛋白表达，增加Bax蛋白表达诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡[10]。促使我们研究亚毒性浓度的ChR能否敏化TRAIL诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。

本文研究显示，ChR(40 μmol/L)与 TRAIL(100 ng/mL)联合诱导SGC-7901细胞的细胞凋亡率分别是单用 ChR 和 TRAIL的 10.7和 13.2倍 (图 1)，提示：亚毒性浓度的ChR能有效增强TRAIL导诱导SGC-7901细胞凋亡。本文最后用琼脂糖凝胶电泳试验发现两者联合处理展示出典型DNA梯形条带图谱(图2)，说明两者合用能诱导 SGC-7901细胞DNA核小体间断裂。证实：亚细胞毒性浓度的ChR具有增强TRAIL诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡作用。

综上所述，本文的结论是ChR具有增敏TRAIL诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡作用，因此，饮食黄酮ChR与TRAIL联合应用可望成为治疗人胃癌的新策略。

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