新疆大蓟总黄酮的超声提取及抗氧化性研究

史礼貌，解成喜*

(新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046)

新疆大蓟总黄酮的超声提取及抗氧化性研究

史礼貌，解成喜*

(新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046)

为研究新疆大蓟总黄酮的超声提取方法及其抗氧化活性，采用乙醇超声提取新疆大蓟中的总黄酮，分光光度法测定新疆大蓟中的总黄酮含量，研究新疆大蓟中黄酮类化合物对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除作用。结果表明，新疆大蓟黄酮超声提取的最佳条件为乙醇体积分数75%、料液比1:30(g/mL)、超声时间45min，该条件下总黄酮提取率为0.289%，新疆大蓟中黄酮类化合物对清除自由基有明显的作用，且黄酮类化合物的添加量在实验范围内与其抗氧化性呈正相关。

分光光度法；新疆大蓟；超声法；总黄酮；抗氧化

大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物(Cirsium japonicumDC.)的干燥地上部分或根[1]，多年生草本，以全草和根入药，我国大部分地区均有分布，种类达上百种。全草灰绿色，大蓟性凉、味甘、苦，功效为凉血止血、行瘀消肿，有效成分主要有黄酮、黄酮苷、挥发油、三萜和甾醇等物质[2-3]。在新疆，大蓟分布广泛，有1 6种之多，是维吾尔医学常用药材。

天然黄酮类化合物是植物体多酚类的内信号分子及中间体或代谢物，广泛存在于中草药中。天然来源的生物黄酮相对分子质量小，能被人体迅速吸收，进而消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑等。近年来国内外对类黄酮的药理和营养性的深入研究和临床试验表明类黄酮既是药理因子又是重要的营养因子，对人体具有重要的生理保健功效[4-6]。本实验研究新疆大蓟总黄酮的超声提取工艺，并对其黄酮提取物进行体外抗氧化性研究，为大规模提取，开发黄酮类化合物及综合利用新疆维吾尔医药资源提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆大蓟采于新疆和田地区于田县，经新疆大学生命科学与技术学院买买提名·莱合曼教授鉴定为丝路蓟(Cirsium arvense)；芦丁对照品 中国药品生物制品检定所。

无水乙醇、9 5%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、焦性没食子酸、双氧水、抗坏血酸、PBS缓冲溶液(pH7.4)、Tris-HCl缓冲液(pH8.2)均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

λ-17紫外-可见光谱仪 美国PE公司；AL204分析天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；CSF-1A超声波发生器 上海超声仪器厂；FW-100型高速粉碎机金坛市医疗仪器厂；722N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取1 2 0℃干燥至质量恒定的芦丁标准品20mg，置于100mL容量瓶中，加适量无水乙醇，使芦丁标准品完全溶解，并用无水乙醇定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液。

准确移取0.2mg/mL芦丁标准溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL，分别置于25mL容量瓶中，加入质量分数5% NaNO2溶液0.6mL，摇匀，再加入质量分数10%的Al(NO3)3溶液0.6mL，摇匀，静置6min，加入1mol/L NaOH溶液4.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。以试剂空白做参比，在最大波长510nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，以芦丁标准溶液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为A=12.5491C＋0.00789，线性关系良好(r=0.9999)。

样品中总黄酮含量的测定：准确吸取5mL总黄酮提取液于25mL容量瓶中，按标准工作曲线法操作。

1.3.2 新疆大蓟总黄酮的抗氧化实验

对·OH的清除作用[7-10]：取7支具塞试管，分别加入0.75mmol/L邻二氮菲溶液1mL，pH7.4的PBS缓冲液2mL，充分混匀后再加0.75mmol/L FeSO4溶液1mL立即混匀。然后向其中5支试管分别加入不同体积的20mg/mL的黄酮提取液，另2支分别为损伤和未损伤管，不加黄酮提取液，在损伤管中加入体积分数0.1% H2O21mL，未损伤管不加H2O2，最后用蒸馏水定容至10mL，摇匀后7支试管于37℃保温1h，测A536，计算·OH清除率。配制同浓度的抗坏血酸做对照。

对超氧阴离子自由基的抑制作用[11-16]：在25℃的恒温水浴锅中，将pH8.2 Tris-HCl缓冲液和3mmol/L邻苯三酚水浴保温10min后，取4mL，加1mL邻苯三酚，摇匀，定容到10mL容量瓶中，立即在320nm处每隔0.5min测一次吸光度(以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白)，计算出邻苯三酚的自氧化率。加入样品后氧化率测定：取4mL pH8.2 Tris-HCl缓冲液，另取5只试管，分别加入不同体积的20mg/mL的新疆大蓟黄酮溶液，加入1mL 3mmol/L邻苯三酚，摇匀定容，同上法测定。结果计算公式：抑制率s/%=(k0－k1)/k0×100，式中，k0邻苯三酚自氧化速率，k1加入提取物后邻苯三酚自氧化速率。

2 结果与分析

2.1 新疆大蓟总黄酮的超声提取[17]

2.1.1 提取溶剂体积分数的选择

准确称取洗净、干燥、粉碎的新疆大蓟粉末1.0g，超声电流为150mA，分别加入45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、100%的乙醇30mL，超声提取20min，所得提取液的颜色随乙醇体积分数增大由黄色渐变为绿色，65%乙醇的提取液为黄绿色，当乙醇体积分数达到100%时，提取液浑浊，这可能是随着乙醇体积分数的增大，会使提取粗品中的杂质含量增加。将各提取液进行紫外-可见光谱扫描，图形有一定的差别，当乙醇体积分数低于65%时，谱图最大吸收不明显，且黄酮络合物吸收峰在480nm附近，乙醇体积分数在70%～80%时，谱图吸收峰明显，最大吸收峰在500～505nm之间，接近芦丁标准吸收峰，故本实验采用75%乙醇做提取溶剂。

2.1.2 超声电流对黄酮类化合物提取率的影响

图1 超声电流对提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic current on extraction rate of total flavonoids

以75%乙醇作溶剂，在超声提取20min和料液比1:30(g/mL)的条件下，采用不同超声电流进行实验。由图1可以看出，黄酮类化合物提取率随超声电流的增大而增加；当超声电流在300mA时，黄酮类化合物的提取率下降。这可能是由于超声电流过大，功率增大，超声波产生的热量过多，降低了质点间的能量传递，导致提取率下降，故选定250mA作为超声波提取电流。

2.1.3 提取时间对黄酮类化合物提取率的影响

图2 超声时间对提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of total flavonoids

以75%乙醇做溶剂，在超声电流为250mA和料液比1:30(g/mL)的条件下，考察不同提取时间的提取率。由图2可见，当提取时间为45min时，黄酮类化合物的提取率最大，高于45min，提取率下降，这可能是长时间的超声波处理，温度升高，导致黄酮类化合物稳定性下降，因此提取时间以45min为宜。

2.1.4 料液比对黄酮类化合物提取率的影响

用75%乙醇做溶剂，超声电流为250mA条件下超声20min，考察不同料液比的提取结果。由表1可见，黄酮类化合物的提取率随着提取溶剂的增加而增加，当提取溶剂体积大于原料质量的30倍时，黄酮类化合物的提取率基本保持不变，故选择料液比1:30(g/mL)。

表1 料液比对提取率的影响Table 1 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

2.2 新疆大蓟中总黄酮含量的测定

称取一定量的新疆大蓟粉末，用75%的乙醇在一定条件下超声提取，将过滤得到的滤液定容，精确移取一定量的溶液，按2.1节方法显色，测定其吸光度，根据标准曲线方程计算黄酮含量。

2.3 最优条件下的平行实验

为证明最佳工艺条件，选取最优工艺条件：75%乙醇、料液比1:30(g/mL)、超声电流250mA、超声45min，平行做3次实验，得总黄酮平均提取率为0.289%，RSD值为1.64%。

2.4 稳定性实验

取最优工艺条件下的样品溶液，按2.1节方法显色后，每隔20min测定其吸光度，在1h内吸光度基本不变，表明黄酮类化合物与铝盐生成络合物显色是稳定的。

2.5 加标回收率实验

向已知含量的样品中添加一定量的芦丁标准品，测定总黄酮含量，计算回收率，结果见表2：回收率在97.6%～104.1%，表明该方法测定结果可靠。

表2 加标回收率实验结果Table 2 Recovery rates for rutin in spiked samples

2.6 新疆大蓟总黄酮抗氧化活性的研究

2.6.1 新疆大蓟总黄酮对·OH的清除作用

参照1.3.2节的测定方法进行·OH的清除作用的测定。参照Fenton反应：H2O2＋Fe2+=OH－＋·OH+Fe3+，若在反应体系中加入邻二氮菲，则能有效地捕捉·OH并产生有色产物，该产物在536nm波长处有强吸收，若加入具有清除·OH功能的被测物，就会与邻二氮菲竞争·OH，从而减少有色产物的生成量，在536nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白作比较，便能测定被测物对·OH的清除作用。从而评价其抗氧化能力[7-8]。

图3 邻二氮菲法比较VC和新疆大蓟黄酮的·OH清除率Fig.3 Scavenging rates of vitamin C and total flavonoids fromCirsium japonicumon hydroxyl free radicals by phenanthroline method

由图3可以看出，在所选质量浓度范围内，新疆大蓟总黄酮对H2O2-Fe2+体系通过Fenton反应产生·OH具有清除作用，且新疆大蓟总黄酮清除·OH的能力随着加入量的增加而上升，即清除率与黄酮的用量存在着一定的量效关系，说明新疆大蓟总黄酮对·OH活性具有一定的清除作用，与同体积的抗坏血酸相比，清除作用接近抗坏血酸。

2.6.2 新疆大蓟总黄酮对超氧阴离子自由基(O2－·)的抑制作用

参照1.3.2中的测定方法进行O2－·的抑制作用的测定。采用邻苯三酚自氧化法，在碱性条件下(pH8.2)，邻苯三酚发生自氧化反应，生成O2－·和有色中间产物，该有色物在320nm波长处有一特征吸收峰。当加入O2－·清除剂时，O2－·的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在320nm波长处吸收峰减小，故通过测定A可以定量判断自氧化反应的程度[14-15]，并可以计算出清除剂的抑制率。

表3 黄酮提取液对的抑制作用Table 3 Inhibition rates of total flovonoids extract with differentconcentrations on superoxide anion free radicals

表3 黄酮提取液对的抑制作用Table 3 Inhibition rates of total flovonoids extract with differentconcentrations on superoxide anion free radicals

样品编号 1 2 3 4 5提取液质量浓度/(mg/mL) 20 40 60 80 100抑制率/% 7.69 28.46 48.46 69.23 90

由表3可以看出，在所选质量浓度范围内，新疆大蓟总黄酮对邻苯三酚自氧化体系所产生的O2－·有一定的抑制作用，且新疆大蓟总黄酮清除O2－·的能力随着黄酮加入量的增加而明显上升，即抑制率与黄酮的用量存在着一定的量效关系。

3 结 论

3.1 超声波提取方法具有操作简便、无需加热、提取率高、速度快、效果好、提取物结构不被破坏等优点，该研究通过超声波提取新疆大蓟总黄酮的单因素试验确定了总黄酮提取的最优条件：7 5%乙醇、超声电流250mA、固液比1:30(g/mL)的条件下超声45min，黄酮提取率可达0.289%。

3.2 抗氧化性实验表明，新疆大蓟总黄酮具有一定的清除羟自由基、超氧阴离子自由基的能力，在所选质量浓度范围内呈良好的量效关系，且在清除羟自由基的能力上接近抗坏血酸。

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Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromCirsium japonicum

SHI Li-mao，XIE Cheng-xi*. .
(Physical and Chemical Analysis Center, Xinjiang Universitymqi 830046, China)

Objective: To explore the optimal ultrasonic extraction processing and antioxidant activity of total flavonoids fromCirsium japonicum. Methods: The total flavonoids inCirsium japonicumwere extracted by ultrasound-assisted alcohol extraction method and the content of total flavonoids was determined by UV spectrophotometry. The antioxidant activity of total flavonoids fromCirsium japonicumwas evaluated by the scavenging capability for superoxide anion and hydroxyl free radicals.Results: The optimal extraction conditions for total flavonoids fromCirsium japonicumwere ethanol concentration of 75%;material/liquid ratio of 1:30 and ultrasonic treatment time of 45 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total flavonoids was 0.289%. The total flavonoids fromCirsium japonicumexhibited an obvious scavenging effect on free radicals.The antioxidant activity of total flavonoids was a dose-dependent in the certain concentration range.

spectrophotometry；Cirsium japonicum；ultrasonic extraction；total flavonoids；antioxidant

O623.54

A

1002-6630(2011)06-0120-04

2010-06-01

史礼貌(1982—)，男，硕士研究生，主要从事天然产物研究。E-mail：38467980@qq.com

*通信作者：解成喜(1953—)，男，教授，本科，主要从事分析化学研究。E-mail：xiecx@xju.edu.cn