衍生分光光度法测定麦麸粗提液中阿魏酸的含量

杨 雪，姚艳艳，张志清*

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

衍生分光光度法测定麦麸粗提液中阿魏酸的含量

杨 雪，姚艳艳，张志清*

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

目的：建立衍生分光光度法测定麦麸粗提液中阿魏酸的含量。方法：以0.6g/100mL FeCl3-0.9g/100mL K3[Fe(CN)6](1:0.9)混合溶液为显色剂，并以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸光度。结果：阿魏酸在2.36～14.16μg/mL范围内，吸光度与阿魏酸的质量浓度呈良好的线性关系(r=0.9996)，最小检出量为0.022μg/mL，平均加标回收率为103.1%。结论：本检测方法操作简便、准确、回收率高，适用于麦麸粗提液中阿魏酸含量的测定。

麦麸；阿魏酸；衍生分光光度法

麦麸是小麦加工的主要副产品，通常占小麦质量的14%～19%[1]。我国麦麸年产量可达2000万吨以上[2]，但综合利用率还不到20%，并且主要作为饲料使用，利用率和价值都很低。大量研究表明，小麦麸皮主要由一些具有明显功能的细胞层组成[3]，不仅含有丰富的膳食纤维、蛋白质、碳水化合物等，还含有多种酚酸，如香草酸、阿魏酸等，后者是含量最高的酚酸[4]。阿魏酸及衍生物具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗菌消炎、抗突变防癌等功能特性[4]，因此在许多方面都有广泛的用途。

目前常应用于阿魏酸测定的方法主要有高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法、薄层色谱(thin layer chromatography，TLC)法、毛细管电泳(capillary zone eletrophoresis，CZE)、紫外(ultra violet，UV)直接测定。其中，HPLC法由于具有极强的分离能力和极高的灵敏度，因而测定准确，是进行天然产物精确定量最佳方法。TLC法和CZE应用时前者一般作为定性分析和半定量分析，而CZE法则需要较高的设备条件，且测定的稳定性还有待优化。UV直接测定法通过测定阿魏酸在特定溶剂中特定波长的吸光度进而确定阿魏酸含量，具有操作简单、成本低廉、分析快速，但由于样品分析时易受到其他物质的影响，导致准确性下降，因此也有研究开始采用一些特异性的衍生反应来测定阿魏酸，但方法的稳定性还有待优化。

本研究前期已经建立了一套超声波辅助碱醇提取HPLC测定麦麸中阿魏酸含量的方法，其平均加标回收率可达97.9%，重复性实验RSD为1.59%[5]。在研究中发现，该法应用于麦麸样品检测具有操作简便、准确、回收率高、重复性好的优点，但其操作复杂，成本较高。利用衍生试剂与待测有机物发生化学反应生成的有色缔合物，采用分光光度法进行分析可避免其他成分或杂质的干扰，且测定快速，可有效应用于有机物含量测定。本实验利用阿魏酸在0.1mL盐酸中能与铁氰化钾-三氯化铁生成深绿色化合物的显色反应[6]，同时选择十二烷基硫酸钠作为表面活性剂。选用上述高效液相色谱法作为对比，建立衍生分光光度法定量分析麦麸粗提液中阿魏酸含量，旨在为更加准确、快速应用于阿魏酸粗提物纯化提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿魏酸粗提物按照文献[7]制备；反式阿魏酸标准品(纯度＞99%) 德国Sigma公司；无水乙醇、十二烷基硫酸钠、铁氰化钾、三氯化铁、盐酸(均为分析纯)，甲醇(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

UNIC7200型分光光度仪 上海优尼科公司； SHZ-82A气浴恒温振荡器 江苏中大仪器厂；高效液相色谱仪[SPD-10A VP紫外-可见检测器、LC-6A高压泵、CTO-10AS VP柱温箱(含7725i型手动进样器)] 日本Shimadzu公司；N2000工作站 浙江大学智达信息工程有限公司；CP225D型电子天平 德国Sartorius公司；Milli-Q型纯水仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

FastEthernet0/1 128.2 128 19 FWD 0 4096 cc00.1ca0.0001 128.2

1.3.1 标准溶液的配制

精确称取阿魏酸标准品0.1180g，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，制成2.36mg/mL阿魏酸溶液。再量取1mL用无水乙醇稀释至50mL，制得0.0472mg/mL的阿魏酸标准溶液，并置于－4℃保存。

1.3.2 显色剂的配制

将0.6g/100mL三氯化铁和0.9g/100mL铁氰化钾以1:0.9比例充分混匀，临用前现配。

1.3.3 检测波长的确定

参考多酚类物质的检测方法并结合实验条件[8-10]，确定检测的波长为720nm。

1.3.4 检测方法

精确量取一定体积的阿魏酸样品置于10mL棕色容量瓶中，加入无水乙醇至2mL，分别加入0.8mL 0.3g/100mL十二烷基硫酸钠溶液(SDS)，0.4mL铁氰化钾-三氯化铁显色剂，摇匀，暗处静置5min，用0.1mol/L盐酸稀释至10mL，在35℃气浴中放置并摇匀20min。放至室温后在720nm波长处检测其吸光度。

2 结果与分析

精确量取阿魏酸标准溶液(0.0472mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，分别置于10mL棕色容量瓶中，并加无水乙醇至2mL，再分别加入0.8mL 0.3g/100mL十二烷基硫酸钠溶液(SDS)，0.4mL铁氰化钾-三氯化铁显色剂，摇匀，暗处静置5min，用0.1mol/L盐酸定容至10mL(此时阿魏酸标准品质量浓度分别为0、2.36、4.72、7.08、9.44、11.80、14.16μg/mL)，在35℃气浴中放置并摇匀20min。放至室温后在720nm波长处依次测定吸光度，每点测定3次，取平均值。

以吸光度为纵坐标(Y)、阿魏酸的质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得到阿魏酸含量的线性回归方程为Y= 0.0556X－0.0565(r=0.9996)。结果表明在2.36～14.16μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 最小检出量测定

按照前处理步骤配制空白溶液，连续20次测定其吸光度(表1)，计算标准差，并且计算置信水平为95%时的最小检出量。实验测定空白样品的平均吸光度为0.001，此衍生分光光度法的最小检出量0.022μg/mL。2.3 精密度实验

表2 精密度实验结果(n=5)Table 2 Results of precision test (n=5)

精确量取阿魏酸标准品0.3mL置于10mL棕色容量瓶中，按1.3.4节进行显色和测定，连续5次测定其吸光度(表2)，其相对标准偏差(RSD)为2.34%(n=5)，说明具有良好的精密度。

表1 最小检出量实验结果Table 1 Minimum detectable amount of ferulic acid

2.4 重复性实验

分别量取5组0.3mL同一批次阿魏酸粗提液样品，按1.3.4节进行显色和测定，以测得的阿魏酸吸光度为指标(表3)，测定重复性实验阿魏酸含量的RSD为4.29%(n=5)，表明方法重复性良好，能满足实验要求。

表3 重复性实验结果(n=5)Table 3 Results of reproducibility tests (n=5)

2.5 稳定性实验

精确量取0.3mL阿魏酸标准品置于10mL棕色容量瓶中，按1.3.4节进行显色，并在黑暗处放置保存，分别于0、2、4h测定吸光度(表4)。RSD为3.08%，证明该方法用于麦麸粗提液阿魏酸在经衍生处理后4h内测定结果均稳定。

表4 稳定性实验结果Table 4 Results of stability test

2.6 加标回收率实验

表5 阿魏酸的加标回收率实验结果Table 5 Average spike recovery rates for ferulic acid

准确量取同一批次阿魏酸粗提液0.1mL(含阿魏酸7.3409μg)于10mL棕色容量瓶中(共6份)，再分别按照V标准品:V样品为0.8:1、1:1、1.2:1 加入阿魏酸标准品(0.0472mg/mL)，然后按检测方法进行操作并计算其回收率(表5)。实验表明在3个不同的添加水平下，阿魏酸测定的平均回收率分别为103.1%，RSD值为3.51%，表明该方法测定的结果比较准确。

2.7 衍生分光法与高效液相色谱法对比

本研究前期建立高效液相测定方法[5]，色谱柱采用Hyperclone BDS C18柱(150mm×4.60mm，5μm)，以甲醇:1%冰乙酸溶液=25:75为流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min，测定波长320nm将3种不同浓度的阿魏酸粗提液分别用衍生分光光度法和上述HPLC法进行检测。并以样品中所含阿魏酸质量浓度为指标，将两种检测结果进行对比，结果见表6。

表6 衍生分光光度法与HPLC法检测结果对比Table 6 Comparison of ferulic acid contents determined by derivatization combined with spectrophotometry and HPLC

由以上实验结果可知分光光度法与高效液相色谱法的测量值相比，相对误差在2%以内。说明该方法测定结果与HPLC法的结果误差小，可以用于阿魏酸粗提液纯化过程的快速分析。同时通过比较HPLC方法[5]与该方法的精密度(RSD值)、稳定性、平均回收率(表7)，前者的精密度、稳定性、以及加标回收率等指标均优于后者，但是衍生分光光度法具有分析成本低，检测时间快的特点。

表7 衍生分光光度法与HPLC法对比Table 7 Comparison of determination methods between derivatization combined with spectrophotometry and HPLC

3 讨 论

3.1 铁氰化钾-三氯化铁反应原理为阿魏酸的酚羟基具有还原性，能将[Fe(CN)6]3-还原成[Fe(CN)6]4-，还原产物[Fe(CN)6]4-接着与Fe3+反应生成Fe4[Fe(CN)6]3(普鲁士蓝)供定量测定。而十二烷基硫酸钠可增加溶液的表面张力，有助于显色剂沉淀的溶解，增强显色的稳定性。李广胜等[6]在测定丹参口服液中总酚酸含量时，选择0.6g/100mL FeCl3-0.9g/100mL K3[Fe(CN)6](1:0.9)混合液作为显色剂，制备检测液时依次加入70%乙醇、0.3%十二烷基硫酸钠、显色剂和0.1mol/L盐酸。但考虑到阿魏酸在无水乙醇和70%乙醇中的溶解度差别不大，其次无水乙醇可以直接使用而不需要配制，因此本实验中选用无水乙醇作为溶剂。黄喜茹等[11]在用铁氰化钾-三氯化铁显色体系测定丹参及其制剂中水溶性酚酸总量时，在使用0.9g/100mL三氯化铁溶液和0.6g/100mL铁氰化钾溶液按1.0:0.9配制而成的显色剂时，在其他实验条件固定的情况下，只改变显色剂的加入量，配制系列测定溶液，分别测定其吸光度。结果表明，显色剂加入量为0.4～0.5mL时吸光度最大且稳定。而在其他条件不变时，改变十二烷基硫酸钠的加入量，配制系列测定溶液，分别测定其吸光度。结果表明，十二烷基硫钠溶液加入量为0.8～0.9mL时溶液显色稳定性最好，最后选择用1mol/L冰醋酸作为溶剂。因此本实验中显色剂(0.6g/100mL FeCl3:0.9g/100mL K3[Fe(CN)6]=1:0.9)加入体积为0.4mL，十二烷基硫酸钠加入体积定为0.8mL，但大量文献使用盐酸作为溶剂，生成的普鲁士蓝沉淀在盐酸中的溶解效果好，因此本实验选择0.1mol/L盐酸作为溶剂。3.2 文献报道从麸皮中提取的酚酸除阿魏酸外，还有异阿魏酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸等，但除咖啡酸以外其他的酚酸在320nm左右没有紫外吸收，其他物质都可忽略不计。龚晓莉等[8]以FeCl3-K3[Fe(CN)6]混合溶液为显色剂，采用分光光度法测定抗菌植物乌蕨中总酚酸含量，选择波长717nm为检测波长。结果表明该检测方法简便可靠、精密度高、重现性好。严赞开[9]在用分光光度法测定仙人掌中多酚含量时，使多酚与三氯化铁-铁氰化钾作用后，在720nm测定其吸光度。付煜荣等[10]在采用分光光度法测定三七中总酚酸含量时，选择FeCl3-K3[Fe(CN)6]混合溶液为显色剂，检测波长为720nm。结果表明此检测方法重现性好。由于阿魏酸也是一种酚酸，因此借鉴上述文献中检测酚酸的方法，选择检测波长为720nm。

3.3 测定阿魏酸常用的方法一般有分光光度法[8-11]和色谱法[5,12-14]，荧光分光法[15]以及毛细管电泳[16]。由于高效液相色谱法具有对多组分的高分离能力，测定简单快速、结果准确、精密度高的特点，因此是目前测定微量有机物最为有效的分析手段[12]。已有的研究方法主要应用于阿魏酸含量较高的中药材。如李琰等[13]在测定不同产地当归中阿魏酸含量时，通过正交实验确定最佳测定条件，其平均回收率平均为(97.6±1.9)%，RSD=0.7%；叶芳等[14]采用Eclipse DBC18柱，方法平均回收率为99.5%，RSD为1.74%。张志清等[5]采用超声波辅助碱醇提取麦麸中阿魏酸，并采用高效液相色谱方法测得方法平均回收率97.9%，RSD 0.64%(表7)。将本研究与上述学者的方法比较，可以看出HPLC法测定阿魏酸时的精密度、稳定性以及平均回收率都比衍生分光光度法高，及测定的数据稳定性和测定准确度高。但高效液相色谱仪价格昂贵，限制了其广泛应用，并且分析较少样品时分析时间较长，操作复杂，测定成本较高，因此在测定较少样品时，可选用衍生分光光度法。

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Determination of Ferulic Acid in Wheat Bran by Derivatization Combined with Spectrophotometry

YANG Xue，YAO Yan-yan，ZHANG Zhi-qing*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Objective: To establish a determination method of ferulic acid in wheat bran by derivatization combined with spectrophotometry. Methods: Ferulic acid was analyzed spectrophotometrically at 720 nm. The color-developing agent was the mixture of 0.6 g/100 mL FeCl3 and 0.9 g/100 mL K3Fe(CN)6] (1:0.9). Results: A good linear relationship in the concentration range of 2.36－14.16μg/mL for ferulic acid (r= 0.9996) was observed, and the detection limit of this developed method was 0.022μg/mL. The average recovery rate of this method was 103.1%. Conclusion: This developed method is characteristics of simple operation, accurate results and high average recovery rate, which is suitable for the determination of ferulic acid in wheat bran.

wheat bran；ferulic acid；derived spectrophotometry

TS210.9

A

1002-6630(2011)06-0155-04

2010-05-04

教育部大学生创新性实验项目(091062627)；四川省人事厅留学人员择优项目(川人函【2008】488号)；

四川省教育厅重点项目(09ZA081)

杨雪(1988—)，女，本科生，主要从事食品检验研究。E-mail：yangxue.smile@163.com

*通信作者：张志清(1976—)，男，副教授，博士，主要从事食品、生物样品检验研究。E-mail：zqzhang721@163.com