气相色谱-质谱法同时测定茶叶中7 2种农药残留量

陈红平，刘 新，汪庆华，蒋 迎

(中国农业科学院茶叶研究所，农业部茶叶质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310008)

气相色谱-质谱法同时测定茶叶中7 2种农药残留量

陈红平，刘 新，汪庆华，蒋 迎

(中国农业科学院茶叶研究所，农业部茶叶质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310008)

建立茶叶中有机氯农药、拟除虫菊酯农药、有机磷农药等72种农药及其异构体多残留的气相色谱-质谱(GC-MS)分析方法。样品加水润湿后，乙腈均质提取，5g/100mL氯化钠溶液与提取液经液液萃取后，再用Carbon/NH2小柱净化，25mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)淋洗。优化色谱条件，采用选择离子监测(SIM)模式进行质谱检测。分别在样品中添加标准农药样品0.1、1.0mg/kg水平上进行添加回收率实验，方法的回收率范围为65.3%～142.3%，相对标准偏差为3.0%～20.6%(n=6)。以信噪比RSN=3计算各农药的最低检出限为0.01～0.08mg/kg范围。该方法结果准确、重现性好，满足茶叶中多种农药残留检测要求。

茶；气相色谱-质谱；农药多残留；液液萃取；固相萃取

茶叶作为全世界三大无酒精饮料之一，已经广泛被人们所接受。茶叶中茶多酚、咖啡碱、多糖等有效成分具有抗癌[1-2]、抑制心血管[3]、延缓衰老[4]、抑制和抵抗病毒等功效[5]，因此，饮茶有益于身体健康。但是，为了防治和减少茶树病虫害的危害，化学农药在茶园中得到广泛使用，尤其是杀虫剂农药，农药的使用一方面提高茶叶的产量，但残留的农药却极大危害人的身体健康，并造成环境污染，危害生态环境。欧盟[6]、日本[7]等国家或地区对茶叶中农药残留做了严格要求，并制定了最大残留限量(MRL)。2002年颁布的《中华人民共和国农业部公告》第199号，明确规定三氯杀螨醇、氰戊菊酯、甲胺磷、甲基对硫磷、久效磷等共计39种农药不得在茶园中使用，同时，食品中农药最大残留限量还规定了茶叶中农药最大残留限量值[8]。

气相色谱法是茶叶中农药残留检测采用的主要手段。气相色谱配备选择型检测器，如电子俘获检测器(electroncapture detector，ECD)、火焰光度检测器(flame photomentric detector，FPD)、氮磷检测器(NPdetector，NPD)等，对茶叶中残留的有机氯农药和拟除虫菊酯农药[9]、有机磷农药[10-11]检测具有准确性高、灵敏度高的特点，因此广泛用于我国茶叶中农药残留日常检测工作。但是，由于农药理化性质的差异以及茶叶基质的干扰，使得气相色谱法难以满足一次性前处理、一次进样分析多种不同种类农药残留量，导致农药残留检测繁琐、分析成本高等不利因素。气相色谱-质谱法可以同时检测茶叶中有机氯农药[12]、拟除虫菊酯农药[13]、有机磷农药和其他类型农药[14]，气相色谱-选择离子监测-质谱联用(gas chromatography with selected ion monitoring mass spectromentric detection，GC-SIM-MS)通过对农药化合物目标离子的监测，使得农药残留检测GCMS方法的进样浓度达到10-15g级别[15-16]，满足了茶叶中农药最大限量值。本实验采用固相萃取净化茶叶中复杂基质，旨在建立茶叶中有机氯农药、拟除虫菊酯农药、有机磷农药等72种农药及其异构体的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

绿茶、乌龙茶、红茶以及普洱茶样品来自抽检样品或茶叶公司送检样品。

乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(色谱级) 美国Tedia公司；氯化钠、无水硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(分析纯) 上海试四赫维化工有限公司；去离子水，电导率低于18mΩ；农药标准样品美国Sigma公司。

表1 72种农药的色谱保留时间、时间片段、驻留时间、定性定量离子、回收率、变异系数及检出限Table 1 Retention time, time segment, dwell time, qualitative and quantitative ions, recovery rates, relative standard deviations and detection limits of 72 pesticide residues

续表1

7890-5975气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、J&W DB-5 毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm) 美国Agilent公司；6mL Carbon/NH2固相萃取柱 美国Varian公司；IKA T18高速均质仪 德国IKA公司；Gilson ASPEC Xli全自动固相萃取仪 法国吉尔森公司； R215旋转蒸发仪瑞士公司。

1.2 色谱、质谱条件

色谱条件：载气为高纯氦气(纯度99.999%)，流速1.0mL/min；进样方式为不分流进样，0.75min后打开分流阀，进样量1μL，进样口温度250℃，连接杆温度280℃；柱温起始温度80℃，保持1min，以15℃/min速率升温到180℃，保留2min，以5℃/min速率升温到280℃保持10.333min。

质谱条件：EI源，70eV；离子源温度：230℃，选择离子扫描模式(SIM)，选择离子参数见表1。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

茶叶(干样)经粉碎后取(5.0±0.01)g于150mL烧杯中，加入5mL去离子水润湿15min，再加入30mL乙腈，12000r/min均质2min，经滤纸过滤于125mL分液漏斗中，分别用10mL乙腈重复洗烧杯两次，合并滤液于125mL分液漏斗中。

1.3.2 净化

在1.3.1节分液漏斗中加入50mL 5g/100mL氯化钠的磷酸缓冲液pH5.8，振荡后静置30min，使乙腈相与水相分层。取乙腈相于100mL鸡心瓶中，在水浴温度40℃，气压125MPa旋转蒸发仪浓缩近干，乙酸乙酯-丙酮(1:1)定容至2mL。5mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)活化Carbon/NH2固相萃取柱，加入以上定容的2mL液体，分别用25mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)混合液以6mL/min速度洗脱，淋洗液浓缩近干，丙酮定容至1mL。

1.4 农药标准样品配制

固体标准样品称取(0.020±0.0001)g，有机磷农药采用丙酮溶解后，丙酮定容至100mL容量瓶中；有机氯、拟除虫菊酯农药用正己烷溶解，定容至100mL。定量标样均采用空白茶叶基质配制：用10μL自动进样针取适量标准样品加入至1mL空白基质中。

2 结果与分析

2.1 GC-MS条件优化

2.1.1 色谱条件

离子的扫描速度是影响目标化合物灵敏度与稳定性至关重要的一个参数，扫描速度越快，单位时间内采集点增加，稳定性增强，但灵敏度下降；反之，则灵敏度增加而稳定性下降，目标化合物采集点数要求在7个点以上才能获得良好的稳定性。质谱参数中驻留时间决定了离子的扫描速度，因此，驻留时间的设置显得尤为重要。总离子流图保留时间分段有利于增加驻留时间从而获得更佳的稳定性与灵敏度。

当采用升温程序1(80℃起始温度，保留1min，然后以15℃/min升温到280℃)时，总离子流图中各农药色谱峰分离度差，保留时间相差太小，难以进行分段处理，如图1a、1b所示。在保留时间10.0～12.2min时间段内，共有25个农药组分(图1a)，碎片离子为75个，将这些碎片离子设置为同一时间段进行扫描，以平均峰宽6s计算，单个离子扫描频率为10计算，则平均单个碎片离子驻留时间为8ms。当采用升温程序2(柱温起始温度80℃，保持1min，以15℃/min速率升温到180℃，保留2min，以5℃/min速率升温到280℃保持10.333min)时，在10.0～12.2min内只有两个农药色谱峰，以平均峰宽6s计算，单个离子扫描频率为10计算，则平均单个碎片离子驻留时间为100ms。因此，时间分段进行离子扫描，增大了碎片离子的驻留时间。另外，当以升温程序1时，甲基对硫磷、皮蝇磷、甲基嘧啶磷、杀螟硫磷、马拉硫磷和毒死蜱含有碎片离子m/z(125±0.5)(图1b)，这6个农药的保留时间分别为11.545、11.742、11.861、11.897、11.975、12.157min，当采用m/z125离子进行定性定量分析时，农药间的交叉干扰势必引入误差或误判结果。采用升温程序2，6种农药的保留时间相差较大(表1)，有效的避免了农药交叉干扰引入的误差。

图1 升温程序1条件下总离子流图Fig.1 Total ion chromatograph determined at the conditions of programmed temperature 1

2.1.2 质谱条件

目标化合物定性定量离子的选择决定了GC-MS检测方法是否准确最为关键步骤。对于相对分子质量较小的离子(小于m/z50)容易造成背景干扰从而影响定性定量分析；另外对于一些柱流失碎片以及进样隔垫引入的碎片离子不应作为定性定量离子，如m/z207、281、149等。为了保证准确的定性，采用离子丰度比和保留时间作为定性标准，当未知化合物与农药标准品保留时间偏差小于0.05s。

对于某些含氯或溴原子的农药，同位素碎片离子在质谱图上会产生特征的离子簇，采用这些离子为扫描离子可提高定性的准确性。如有机氯农药六六六的4个异构体，含有6个氯原子，它的碎片离子C6H4Cl3的同位素族的质荷比为m/z181、183、185、 187的丰度为27:27:9:1。把离子存储窗口定位m/z181～183，六六六可产生强度相等的m/z181和m/z183两个峰。当丰度比不符合规律时可以判断由于样品或柱流失产生了干扰，应当选择其他离子进行鉴定，这样就增加了鉴定的准确性[17]。

在实验条件下得到的茶叶空白样品、72种农药茶叶基质混合标准溶液及加标茶叶样品的总离子流色谱图见图2。

图2 茶叶空白样品、基质标样、添加标准样品SIM离子图Fig.2 SIM chromatograph of blank sample, tea matrix with standards and the samples at the spiked level of 0.1 mg/kg

2.2 样品前处理

茶叶为多年生木本植物，含有丰富的化学成分，如茶多酚、咖啡碱、氨基酸、色素及其他组分[18]，因此茶叶中农药残留检测方法中净化步骤尤为重要。对于乌龙茶、普洱茶等颜色较深的茶叶样品在未经液液萃取时，旋转蒸发仪浓缩时有气泡形成，并难以将提取液(乙腈)浓缩近干，同时出现深颜色乳油状物质，导致回收率非常低。Carbon/NH2固相萃取柱对于色素、咖啡碱以及氨基酸有较好的吸附作用[19-20]，茶叶样品经Carbon/NH2固相萃取柱净化后呈透明状。二氯甲烷-丙酮(1:1)作为淋洗液对于大部分农药的回收率在70%～130%，但二氯甲烷具有非常大的毒性，对检测人员的身体伤害较大。乙酸乙酯-丙酮(1:1)替代二氯甲烷-丙酮(1:1)同样可以达到回收率满意的结果(表1)，因此，本实验采用25mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)淋洗、Carbon/NH2固相萃取柱净化作为净化手段。

2.3 方法准确性与精密度

本方法检测的农药中六六六、滴滴涕分别存在4种异构体，包括α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六和p,p＇-滴滴伊、p,p＇-滴滴滴、o,p＇-滴滴涕、p,p＇-滴滴涕。这两种农药的定量均采用相应的异构体标准样品进行定量再进行加和计算总含量[21]。硫丹、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、氰戊菊酯等9种农药的异构体定量采用异构体加和再进行定量分析[22-23]。

分别将0.5、5.0mg/L的标准溶液添加1mL于5.0g空白茶叶样品中，进行回收率测试。每个样品重复6次，计算相对标准偏差(RSD)，各农药的平均回收率、RSD(表1)。方法平均回收率除甲胺磷65.3%、敌敌畏68.9%、乙酰甲胺磷66.7%、久效磷66.7%、亚胺硫磷143.2%和联苯菊酯124.3%外，其他农药的平均回收率均在70%～120%范围内。方法RSD(RSD)除百菌清20.6%、久效磷17.8%和乙酰甲胺磷15.4%外，其他均在3.0%～15.0%范围内。由表1可见，回收率范围为65.3%～142.3%，相对标准偏差为3.0%～20.6%(n=6)，以RSN=3为计算方法，各农药的最低检出限(LOD)均在0.01～0.08mg/kg范围内，满足茶叶中农药残留限量检测要求，均低于我国茶叶中农药残留最大限量标准和欧盟法令、日本肯定列表最大残留限量值。

3 结 论

本实验建立茶叶中72种农药残留GC-MS检测方法。方法中各农药的最低检出限均低于我国茶叶中农药残留最大限量标准和欧盟法令、日本肯定列表最大残留限量值。方法准确、简单、可靠，能够满足我国茶叶中农药残留日常检测工作要求。

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Simultaneous Determination of 72 Pesticide Residues in Tea by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHEN Hong-ping，LIU Xin，WANG Qing-hua，JIANG Ying
(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Tea Quality and Supervision Testing Center,Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China)

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was developed for the simultaneous determination of 72 pesticides and their isomers including organochlorine, pyrethriod, organophosphorus and other pesticides in tea. After moistened by water, the samples were subjected to extraction by acetonetrile, preliminary clean up by 5 g/100 mL sodium chloride,and further purification on carbon/NH2 column through the elution using 25 mL of ethyl acetate-acetone (1:1). The MS detection was performed in the selected ion-monitoring mode under the optimal chromatographic conditions. The recovery rates were determined in samples spiked at 0.1 mg/kg and 1.0 mg/kg. The overall recovery rates were 65.3%－142.3%, with a relative standard deviation (RSD) between 3.0% and 20.6%. The detection limit of this method was 0.01－0.08 mg/kg with a signal/noise ratio of 3. This developed method is characteristics of high sensitivity and accuracy, which is suitable for the simultaneous determination of pesticide residues.

tea；GC-MS；multiple residues；LLE；SPE

TS207.5

A

1002-6630(2011)06-0159-06

2010-04-15

现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-26)

陈红平(1 97 7—)，男，助理研究员，硕士，研究方向为农药残留、茶叶质量安全。E-mail：thean27@mail.tricaas.com