原子荧光光谱法测定富硒螺旋藻片中不同形态、价态的硒

王 梅，张红香，邹志辉，杨冰仪，陈 健

(1.广东药学院公共卫生学院，广东 广州 510310；2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264003)

原子荧光光谱法测定富硒螺旋藻片中不同形态、价态的硒

王 梅1，张红香2，邹志辉1，杨冰仪1，陈 健1

(1.广东药学院公共卫生学院，广东 广州 510310；2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264003)

采用氢化物发生原子荧光法测定两种富硒螺旋藻片中不同形态和价态的硒含量。研究仪器原子化器高度、盐酸、硼氢化钾浓度对硒荧光信号值的影响，比较微波和湿法消化两种消化方法，以及反复冻融和超声波细胞粉碎法对蛋白溶出率的影响。结果显示，两种消化方法无显著性差异(P=0.6900)，反复冻融法所得硒含量仅为超声波细胞粉碎法的25%～30%，超声波细胞粉碎法优于反复冻融法。在最佳实验条件下，测得两种富硒螺旋藻片硒含量有显著性差异(P＜0.0001)，但都存在无机态和有机态的硒，并以有机硒为主，占60%左右，且主要是以蛋白质结合的形式存在，无机态的四价硒和六价硒含量，样品1有显著性差异(P=0.0094)，但样品2的四价硒和六价硒含量无统计学差异(P=0.2269)。方法的检出限为0.64ng/g，加标回收率为93.0%～98.8%，该方法操作简便，灵敏度高，检出限低，线性范围宽，可作为不同形态和价态的硒含量的测定方法。

原子荧光；富硒螺旋藻片；硒；形态；价态

硒(selenium)是唯一受基因调控的人体必需微量元素，具有多种重要的生物学功能，硒的缺乏和过剩都将导致多种疾病[1-2]。我国大部分地区为缺硒、少硒地区，一般是通过食品强化来解决补硒问题。近年来许多微生物、植物甚至动物都被作为硒的生物有机化载体进行研究，且已开发出高附加值的富硒产品，富硒螺旋藻就是其中之一。

目前，国内富硒螺旋藻中的硒形态分析主要采用荧光法[3-4]、电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES)[5]，但还未见应用原子荧光光谱法研究富硒螺旋藻中硒形态、价态的报道。螺旋藻片在加工过程中因加入了其他的辅料，介质比较复杂。本实验通过对样品前处理、原子化高度、载流、硼氢化钾质量浓度等方面进行研究，旨在建立采用原子荧光光谱法对富硒螺旋藻片中的硒形态、价态分析的方法，以期为研究富硒螺旋藻片中硒的营养效应提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒螺旋藻片2种均为市售品牌，标记为样品1和样品2。样品经55～60℃干燥24h，研磨后使用。

1mg/mL硒标准储备液 国家标准物质中心；40μg/L硒标准使用液，临用前逐级稀释；实验用试剂均为优级纯或分析纯；实验用水为3次石英亚沸蒸馏水；实验用玻璃仪器均用质量分数10%硝酸浸泡24h，再用1次水及3次蒸馏水洗净。

1.2 仪器与设备

AFS-920双道原子荧光光谱仪 北京吉天仪器有限公司；22R型台式冷冻离心机 德国Hettich公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪 宁波新艺超声设备有限公司；MDS-2003型微波消解仪 上海新仪微波化学科技有限公司；EH35A型电热板 北京莱伯泰科公司；CU-420型数显恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；BT224S万分之一天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 仪器工作条件

灯电流30mA，光电倍增管负高压260V，原子化器高度9mm，载气流量400mL/min，屏蔽气流量800mL/min，测定方法采用标准曲线法，读数方式为峰面积，进样体积1.0mL。

1.4 样品处理

1.4.1 总硒

准确称取样品0.1～2.0g，于50mL锥形瓶中，加入15mL HNO3-HClO4(4:1，V/V)的混合酸冷消化过夜，次日于电热板上加热，及时补加酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积2mL左右。冷却，再加5mL 6mol/LHCl溶液，于电热板上加热赶酸至约2mL，消化液转移到10mL比色管中，加纯水定容至10mL，加入1mL 100g/L铁氰化钾，2mL浓盐酸摇匀，备测[6]。每种样品平行测定6份，同时做试剂空白。

1.4.2 无机硒与有机硒

准确称取样品0.1～2.0g，加入10mL的3次蒸馏水，沸水浴30min，然后用超声波细胞粉碎机粉碎细胞壁(功率550W，超声时间4s，间隔时间4s，超声60次)，20℃条件5000r/min离心10min。残渣同上步骤再提取，合并上清液，浓缩至5mL左右，按1.4.1节步骤消解，所得消解液用于测定的硒即为无机硒含量。

将总硒减去无机硒作为有机硒的含量。

1.4.3 Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)

将无机硒提取液浓缩消化后，不加入6mol/L HCl溶液还原，只加入100g/L铁氰化钾溶液抗干扰剂所测出的为四价硒，六价硒的含量为无机硒的含量减去四价硒的含量。

1.4.4 蛋白质中的硒

准确称取样品0.1～2.0g，加pH8.6 Tris-HCl缓冲液(质量分数10%甘油、20.0mmol/L MgCl2·6H2O)10.0mL混合，置于超声波细胞粉碎机，使细胞全部破碎。搅拌提取2次，以4℃条件下11000r/min离心10min，上清液合并；加入固体硫酸铵至饱和，静置2h，以15000r/min离心10min，收集沉淀；用5mL的缓冲液溶解沉淀，用截留相对分子质量为7000的透析袋在蒸馏水中透析去除硫酸铵，收集蛋白质溶液[4]，再按1.4.1节步骤消解。

1.4.5 多糖中的硒

准确称取样品0.1～2.0g，先用95%乙醇溶液脱脂，再加10mL三次蒸馏水，80℃恒温加热4h，离心(3000r/min，20min收集上清液，沉淀再加水10mL， 80℃恒温加热4h，抽提2次，合并上清液。上清液浓缩至5mL左右，用80%丙酮溶液脱色，再用95%乙醇溶液沉淀，离心，合并两次所得沉淀[7-8]，再按照1.4.1节方法消化。

1.4.6 数据分析方法

数据分析主要利用SAS 9.1，统计分析方法主要有t检验、t′检验或配对t检验。

2 结果与分析

2.1 测定条件的选择

以10μg/L硒标准溶液的测定荧光强度为指标，考察盐酸载流浓度、硼氢化钾质量浓度、原子化器高度3个因素对测定结果的影响。采用L9(34)进行正交试验，结果表明质量分数5%盐酸，10g/L硼氢化钾，原子化高度9mm为最佳测定条件。

2.2 微波消化与湿消化法的比较

分别采用微波和湿法消化对两种样品进行前处理，测定结果表明两种消化方法无显著性差异(P=0.6900)。微波消化可以避免挥发性元素的损失，且较少有污染发生，但每次处理样品量较少，通常为0.1～0.5g，对含量较低的元素测定不适用。湿法消化是应用普遍的方法，其特点是单次处理样品数量较大，可达到10g以上，基本能满足植物样品中微量元素测定的要求。考虑到样品2含硒量比较低，称样量达到2.0g左右，且因富硒螺旋藻片在加工过程中加入了其他的辅料，介质比较复杂，消化时有较多气泡产生，微波消化预处理时间较长，故选用湿消化法。

2.3 关于藻体蛋白提取的方法比较

参考刘力闯[9]、郑江[10]、黄峙[4]等对于螺旋藻中蛋白的提取，采用反复冷冻盐析法和超声波细胞粉碎法提取藻体蛋白，利用所测得硒含量来对比两种方法。实验结果表明冷冻盐析法所得硒含量仅为超声波细胞粉碎法的25%～30%，可见冷冻法的蛋白溶出率比超声波细胞粉碎法的蛋白溶出率低得多，故选用超声波细胞粉碎法提取富硒螺旋藻中蛋白。

2.4 富硒螺旋藻片中硒形态、价态及含量

螺旋藻是硒生物有机化的理想载体[3,11-12]。硒的生物效应与其化学形态密切相关。硒在生物体内的存在形态可分为有机态和无机态，无机硒毒性大，而有机硒毒性小、生物利用率高。有机硒主要存在蛋白、多糖和脂质中。无机硒有单质硒(Se 0)、4价硒(Se Ⅳ)及6价硒(Se Ⅵ)之分[3]。因此不同形态、价态的硒含量是评价某一富硒产品营养价值的重要指标。

氢化物发生-原子荧光光谱法测硒具有灵敏度高、干扰小、线性范围宽、所用试剂毒性小等优点，特别在硒价态分析方面具有方便快捷的优势[13-15]。

硒形态、价态分析结果表明(表1)，两种富硒螺旋藻片硒含量有显著性差异(P＜0.0001)，样品1总硒含量是样品2的2000多倍，但都存在无机态和有机态的硒，且以有机硒为主，占60%左右，样品1中无机态的四价硒和六价硒含量有显著性差异(P=0.0094)，但样品2的四价硒和六价硒含量无统计学差异(P=0.2269)。由此看出，富硒螺旋藻片中硒的有机化程度较高，可较好地被生物所吸收利用。

表1 富硒螺旋藻片中硒形态、价态及含量(n=6)Table 1 Chemical states, valences and contents of Se in Se-enrichedS.pirulinatablets (n=6)

2.5 有机硒在螺旋藻片中的分布

有机硒主要指以负2价态结合在蛋白质、脂、多糖、核酸、氨基酸、多酚、甾类化合物等有机分子特别是生物分子中的硒。由表2可知，两种样品中蛋白质和多糖含硒量均有显著性差异(P＜0.0001)，有机硒在螺旋藻中的分布从大到小为蛋白质、多糖，且蛋白质结合的硒占有机硒的比例超过50%，远高于多糖，说明有机硒主要是以蛋白质结合的形式存在。

表2 蛋白质、多糖中的含硒量(n=6)Table 2 Protein-bound selenium and polysaccharide-bound selenium contents in Se-enrichedS.pirulinatablets (n=6)

2.6 检测限和加标回收率

按照硒总量的测定方法，以3次蒸馏水代替样品进行6份空白实验，根据空白值计算标准偏差(σ)，按3σ计算出方法检出限为0.64ng/g，测量10次样品得到相对标准偏差RSD为5.7%。实验采用加标回收率的实验考察测量方法的准确性(表3)，其中样品1的加标回收率为95.6%～98.8%，样品2的加标回收率为93.0%～96.2%，说明方法准确度较高。

表3 总硒加标回收实验Table 3 Recovery rates for Se in Se-enrichedS.pirulinatablets

3 结 论

采用原子荧光光谱法分析了富硒螺旋藻片中的硒形态和价态，该方法操作简便、灵敏度高、检出限低、线性范围宽，为研究富硒螺旋藻片中硒的营养效应提供基础。结果表明，不同品牌的富硒螺旋藻片硒含量有显著性差异(P＜0.0001)，但不同形态、价态的硒在螺旋藻片中分布基本一致，并以有机硒为主，且主要是以蛋白质结合的形式存在，硒的有机化程度较高。富硒螺旋藻片作为一种硒营养强化食物，不同品牌硒含量有较大差别，高达2000多倍，这样人们就很难控制硒摄入量，国家法规政策若能有针对性的控制硒含量在一定的范围内，可以使富硒螺旋藻片品质得到优化，从而提高此类产品的营养性和安全性。

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Determination of Chemical State and Valence for Selenium in Se-enrichedS.pirulinaTablets by Atomic Fluorescence Spectrometry

WANG Mei1，ZHANG Hong-xiang2，ZOU Zhi-hui1，YANG Bing-yi1，CHEN Jian1
(1. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, China；2. Shandong Luye Pharma Group Co. Ltd., Yantai 264003, China)

Selenium contents with different chemical states and valences in two kinds of Se-enrichedS.pirulinatablets were determined by atomic fluorescence spectrometry generated from hydride. The effects of atomizer height, HCl concentration and KBH4 concentration on Se fluorescence signal were investigated. The microwave digestion and wet digestion were also compared.In addition, the effects of ultrasonic cell-break method and repeated freezing-thaw method on the extraction rate of protein were explored. Results indicated that two digestion methods had no significant difference (P= 0.6900), and selenium content in samples treated by repeated freezing-thaw method was only 25%－30% of that treated by ultrasonic cell-break method, which suggested that ultrasonic cell-break method was better than repeated freezing-thaw method. Under the optimal conditions,selenium contents in Se-enrichedS.pirulinatablets were significant difference (P< 0.0001). Although both inorganic Se and organic Se co-existed, the organic Se in the states of Se (IV) and Se (VI) was still prominent, which was up to 60%. The contents of Se in both states in sample 1 revealed a significant difference (P= 0.0094), but the contents of Se in both states in sample 2 had no significant difference(P= 0.2269). The detection limit of this method was 0.64 ng/g, and the recovery rate of spiked samples was in the range of 93.0%－98.8%. Therefore, this method is characteristics of simple operation, high sensitivity and low detection limit, and provides a theoretical reference for determining the content of Se in different states and valences from Se-enrichedS.pirulinatablets.

atomic fluorescence spectrometry；Se-enrichedS.pirulinatablets；Se；chemical state；valence

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0179-04

2010-04-15

王梅(1978—)，女，实验师，硕士，主要从事卫生检验与食品分析研究。E-mail：wmei02@163.com