黄芩甙对牙周炎小鼠血清白细胞介素-6和白细胞介素-4水平的影响*

饶利佳, 卢嘉健, 吕芳丽, 李东健， 黄世光△

(1暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632；2中山大学医学院寄生虫教研室，广东 广州 510080；3广州市荔湾区口腔医院， 广东 广州 510170)

黄芩甙对牙周炎小鼠血清白细胞介素-6和白细胞介素-4水平的影响*

饶利佳1, 卢嘉健1, 吕芳丽2, 李东健3， 黄世光1△

(1暨南大学医学院口腔医学系，广东 广州 510632；2中山大学医学院寄生虫教研室，广东 广州 510080；3广州市荔湾区口腔医院， 广东 广州 510170)

目的观察黄芩甙对小鼠实验性牙周炎血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)的影响，探讨黄芩甙对牙周炎的免疫调节作用机制。方法建立小鼠实验性牙周炎模型，并予以黄芩水提取物灌胃治疗。 实验采用SPF级12周龄雄性KM小鼠27只，随机分为3组：正常对照组；实验性牙周炎组：参照Kimura等的方法，复制小鼠实验性牙周炎模型；黄芩甙治疗组：复制小鼠实验性牙周炎模型，并于建模后5 周开始用黄芩水提取物灌胃。各组小鼠分别在建模后第4、6、8 周分批处死，各时点每组处死动物数为3只。制作牙体牙周组织联合切片，观察牙周的组织学改变；采用ELISA法检测实验性牙周炎小鼠外周血IL-6和IL-4的水平。结果实验性牙周炎组牙周组织表现为中等程度的炎症破坏，而黄芩甙治疗组牙周组织炎症程度较牙周炎组明显减轻，修复反应明显；牙周炎组血清IL-6水平显著高于正常对照组和黄芩甙治疗组(P<0.01)；黄芩甙治疗组血清IL-6的含量在6和8 周时显著低于牙周炎组(P<0.01)；牙周炎组血清IL-4水平显著低于正常对照组和黄芩甙治疗组(P<0.01)，而黄芩甙治疗组血清IL-4的含量在6和8周时显著高于牙周炎组(P<0.01)。结论牙周炎的发病过程与Th1/Th2细胞因子的失调密切相关，表现为IL-6升高，IL-4降低；黄芩甙通过降低牙周炎IL-6的含量，增加IL-4的分泌量，纠正牙周炎Th1/Th2细胞因子的失调状况，对小鼠实验性牙周炎有明显的治疗效果。

牙周炎； 白细胞介素类； 黄芩甙

近年来研究表明牙周致病菌诱导以Th1为主的细胞免疫反应[1]，可不同程度地促进牙龈组织炎症、加速牙周结缔组织的破坏和牙槽骨的吸收。大鼠被动转移实验显示Th1细胞因子可加重牙周疾病和牙槽骨吸收，而Th2细胞因子主要介导体液免疫反应，对牙周病具有防护作用[2]。体内外研究显示黄芩甙(baicalin)在清除氧自由基、抗炎和免疫调节等多方面具有作用[3]。本实验通过检测牙周炎小鼠牙周的组织学改变，同时检测血清中细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)的水平变化，分析黄芩甙对小鼠牙周炎的治疗效果，从细胞免疫学的角度分析其免疫调节的作用机制。

材 料 和 方 法

1材料

清洁级昆明(KM)小鼠购自中山大学医学院实验动物中心；黄芩提取物(黄芩甙含量：≥90% HPLC)由香港大学陈剑萍助理教授惠赠；小鼠IL-4和IL-6 ELISA检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。

2方法

2.1实验动物分组及牙周炎动物模型的建立

① 动物分组 SPF级12周龄雄性KM小鼠27只，体重约32-36 g，于室内采光条件良好、清洁、安静、通风良好、室温约22 ℃左右、光照周期12 h∶12 h、无特殊致病菌的环境中适应性饲养1周后实验。小鼠按随机数字表法分成3组, 每组9只: (1) 正常对照组(control group)：动物正常喂养,牙周不做特殊处理； (2) 实验性牙周炎组(experimental periodontitis group)：参照Kimura等[4]的方法，用5-0无菌医用缝合丝线结扎双侧上颌第1磨牙牙颈部，管饲接种牙周致病菌，并辅以10%葡萄糖水喂养4周，建立小鼠实验性牙周炎模型；于建模后5周开始蒸馏水灌胃，连续观察至第8周；(3) 黄芩甙治疗组(Baicalin treatment + periodontitis group)：同上法复制实验性牙周炎模型，并于建模后5 周开始用黄芩水提取物混悬液(0.48 g·kg-1·d-1)灌胃，连续观察至第8周。分别于术后第4、6和8周分批处死小鼠,各时点每组处死的动物数为3只。

② 牙周炎动物模型的建立 实验开始前3 d，用氨苄青霉素溶液0.2 mL(含氨苄青霉素2 mg)灌胃，每天1次，连续3 d，抑制内源性杂菌生长，保证牙周致病菌的成功种植。建模时用0.7%戊巴比妥钠溶液[0.1 mL/10 g BW(body weight)ip]麻醉,取仰卧位，固定四肢及头部于手术台上。1%碘酊消毒口腔及口周，并用75%乙醇脱碘，用尖探针分离双侧颌第1磨牙牙龈组织，用5-0丝线嵌入第1、2磨牙邻间牙颈部，于第1磨牙近中牙龈乳头处结扎固定，在前庭沟区打结，结扎线置于龈沟内。造模后喂10%葡萄糖注射液，连续观察4周。

收集临床确诊为慢性牙周炎患者的病变区域龈缘下细菌，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸盐溶液的小瓶中，并充分混匀，以生理盐水进行10倍系列稀释，选择稀释度为10-3的浓度接种于CDC厌氧血琼脂平板上，在厌养菌培养箱中37 ℃培养5 d，用PBS 溶液洗脱离心收集湿菌，用培养液制成细菌悬液以备接种用。实验性牙周炎组、黄芩治疗组小鼠经丝线结扎牙颈部后通过管饲方法，每只小鼠每次给予菌悬液0.2 mL，初次接种后每48 h追加1次，共管饲菌悬液3次。

黄芩提取物按小鼠体重折算的计量以蒸馏水配成混悬液(0.48 g·kg-1·d-1) 灌胃，从结扎的第5周起开始灌胃给药，连续观察4周；正常对照组、实验性牙周炎组从第5 周起每天给予等量的蒸馏水灌胃。

2.2观察指标及检测方法

① 组织学观察 采用颈椎脱臼法处死小鼠，取上颌骨标本于10%中性福尔马林液中固定48 h以上，修整标本，仅保留磨牙区段牙齿及牙周组织。采用混合脱钙液脱钙，制成颊舌向5 μm厚度的牙体牙周组织联合切片，HE染色，光学显微镜下观察结合上皮、上皮下炎症细胞浸润及牙槽骨的吸收情况。

② 血清标本的采集和IL-6、IL-4含量的测定 小鼠于剖杀时心脏取血，置于无菌不含抗凝剂的试管中, 室温静置2 h，放置4 ℃过夜, 3 000 r/min离心10 min,分离收集上层血清,于-20 ℃冰箱内冷冻保存。采用ELISA法检测小鼠血清IL-6的含量：用抗小鼠IL-6单抗包被于酶标板上，复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，加入酶底物四甲基联苯胺，经酶作用后显天蓝色，加终止液硫酸反应后变黄色，在波长为450 nm处测吸光度(absorbance,A)值，通过绘制标准曲线求出标本中IL-6浓度。IL-4检测方法同上。

3统计学处理

结 果

1组织学改变

正常对照组：牙龈上皮及结合上皮完整，牙周膜

胶原纤维排列整齐，牙槽骨完整无吸收，见图1A。牙周炎组：4周时结合上皮及附近见慢性炎细胞浸润，血管扩张充血，可见轻度牙槽骨吸收,见图1 B；6周时结合上皮下见明显炎细胞弥漫浸润，胶原纤维排列紊乱，牙槽骨中度吸收,见图1C；8周时，胶原纤维破坏、结构消解，可见大量炎症细胞浸润，牙槽嵴及牙槽骨明显吸收,见图1D。黄芩甙治疗组， 4周时与牙周炎组的情况基本相似,见图1E ；6周时结合上皮水肿、增生、上皮下方及结缔组织均有轻度的炎细胞浸润，牙周膜纤维排列不规则，牙槽骨轻度吸收，骨小梁稀疏,见图1F；8周时淋巴细胞浸润明显减少，牙周膜纤维排列较整齐，胶原纤维粗大，骨吸收陷窝消失，可见牙槽骨新生迹象,见图1G。

Figure 1. Histological changes in periodontal tissues(HE staining, ×10). A: normal control group; B:experimental periodontitis group (4 weeks), moderate inflammation was present; C: experimental periodontitis group (6 weeks), severe inflammation was present; D: experimental periodontitis group (8 weeks), severe periodontal destruction was present; E: baicalin treatment + periodontitis group (4 weeks), moderate inflammation was present; F: baicalin treatment + periodontitis at group ( 6 weeks), a small number of inflammatory cells were observed ; G: baicalin treatment + periodontitis group (8 weeks), only mild inflammation was found.

图1各组牙周组织HE染色光镜下观察结果

2白细胞介素水平

小鼠血清IL-6水平见表1，实验性牙周炎组IL-6水平明显高于正常对照组和黄芩甙治疗组(P<0.01)；黄芩甙治疗组血清IL-6的含量在6和8周时显著低于牙周炎组(P<0.01)；黄芩治疗组血清IL-6的含量在6和8周时与正常对照组相比较无显著差异(P>0.05)。

小鼠血清IL-4的水平见表2，实验性牙周炎组IL-4水平明显低于正常对照组和黄芩治疗组(P<0.01)；黄芩甙治疗组血清IL-4的含量在6和8 周时显著高于实验性牙周炎组(P<0.01)；黄芩甙治疗组血清IL-4的含量在6和8 周时与正常对照组相比较无显著差异(P>0.05)。

表1各实验组及对照组小鼠血清IL-6浓度的变化

Group4weeks6weeks8weeksControl28．42±4．1529．30±3．5728．01±4．06Periodontitis49．21±3．62∗∗48．53±5．29∗∗ 50．00±4．31∗∗Baicalintreatment+periodontitis48．53±3．58∗∗30．47±4．61▲▲ 29．57±5．35▲▲

**P<0.01vscontrol group；▲▲P<0.01vsperiodontitis group.

表2各实验组及对照组小鼠血清IL-4浓度的变化

Group4weeks6weeks8weeksControl22．64±3．0621．30±3．1021．01±2．81Periodontitis11．78±1．41∗∗12．93±1．39∗∗ 12．00±1．56∗∗Baicalintreatment+periodontitis12．16±1．65∗∗19．98±1．21▲▲ 19．70±1．46▲▲

**P<0.01vscontrol group；▲▲P<0.01vsperiodontitis group.

讨 论

目前研究显示牙周炎的发病过程与细胞因子的分泌异常导致促炎/抑炎平衡失调有密切关系，即Th1细胞功能相对亢进，Th2细胞功能不足。IL-6能刺激破骨细胞分化和骨吸收，抑制牙槽骨形成；抑制牙周膜细胞的生长和牙周膜的修复；促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的生成，加重牙周组织的病变[5]。我们在本实验中观察到小鼠牙周炎时结合上皮及附近结缔组织见炎细胞浸润，胶原纤维排列紊乱，牙槽嵴及牙槽骨明显吸收；血清IL-6含量显著升高，IL-4含量明显下降，结果显示牙周炎时Th1/Th2应答平衡的失调导致牙周炎加重，纠正这种Th1/Th2应答失衡有利于改善牙周炎的病变进程。近年来一些学者采用介导Th2反应的病原体(如肠道蠕虫等)和介导Th1反应的病原体(如细胞内原虫、细菌和病毒等)共感染，研究体内Th1/Th2细胞因子平衡的相互调节对疾病病程的影响，取得了有重要价值的实验治疗效果[6-8]。我们近期的研究工作显示，与对照组相比，牙周炎造模小鼠接种低剂量旋毛虫(Trichinellaspiralis) 诱导Th2细胞反应使牙周病指征明显减轻[9,10]。已知IL-6、TNF-α和IL-1β等是造成牙周炎的细胞因子网络中的关键成员，如果我们能够对这些因子的产生及其生物学效应进行有效的调控就可以减轻其对牙周组织的损害，对牙周炎的治疗有着积极的意义，有望成为牙周炎免疫治疗的有效手段。

黄芩提取物为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根提取而得，其有效成分为黄芩甙。 黄芩甙对多种细菌包括厌氧菌、皮肤真菌、钩端螺旋体等都有抑制作用；黄芩水浸膏对牙龈卟啉单胞菌及牙周可疑致病菌的生长及内毒素有抑制作用，但不对牙周有益菌如血链球菌等产生抑制作用[11]。黄芩黄素能抑制金黄色葡萄球菌外毒素诱发的T淋巴细胞的增殖，降低炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α和巨噬细胞炎症蛋白的水平，降低由内毒素刺激的一氧化氮(nitric oxide，NO)合成，起到抗炎作用。黄芩甙能抑制牙周膜细胞合成分泌前列腺素 (prostaglandins, PGs)，并使PGs如PGE1和PGE2在5-羟前列腺素脱氢酶催化下失活；抑制细胞内炎症介质白三烯B4和白三烯C4的生物合成；黄芩黄素还能显著促进牙龈成纤维细胞增殖及胶原蛋白的合成[12]。黄芩甙通过抑制诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)，减少毛细血管内皮细胞释放NO，调节花生四烯酸的代谢，抑制PGE2和白三烯C4的合成[13]；通过选择性抑制MMP-9等的表达而有效抑制TNF-α的功能[14]。本实验的数据与其它一些研究结果相一致[15,16]，本研究的结果表明黄芩甙可抑制Thl细胞反应，降低IL-6的水平；我们的实验结果还表明黄芩甙同时具有促进Th2细胞反应，升高IL-4的水平，对牙周炎具有显著的治疗效果，研究结果将为药物治疗牙周炎开辟一条新途径。

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EffectsofbaicalinonserumlevelsofIL-6andIL-4inmouseperiodontitis

RAO Li-jia1, LU Jia-jian1, LÜ Fang-li2, LI Dong-jian3, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of baicalin on experimental periodontitis in mouse model by comparing the histological changes in periodontal tissues and serum levels of inter leukin(IL)-6/IL-4 in mice, and to analyze the role of baicalin in immune regulation and anti-inflammatory mechanisms.METHODSTwenty-seven male Kunming mice (SPF grade, 12-week-old) were randomly divided into 3 groups. The naive mice were used in normal control group. In experimental periodontitis group, the periodontitis model was produced by ligature of braided silk around the first maxillary molar and inoculation with putative periodontopathic bacteria. Five weeks after the ligature, the mice were fed with 10% glucose, and gavaged with distilled water. In baicalin treatment+periodontitis group, the periodontitis model was induced as above, then gavaged with baicalin at the beginning of the fifth week after the ligature. The mice were sacrificed at week 4, 6 and 8. The histological changes of the periodontal tissues were observed under microscope with hematoxylin and eosin (HE) staining. The serum level of IL-6 and IL-4 in the mice were determined by ELISA.RESULTSThe periodontal tissues showed moderate inflammatory damages in experimental periodontitis group. The periodontal destruction was significantly reduced in baicalin treatment+periodontitis group. The serum level of IL-6 in experimental periodontitis group was significantly higher than that in control group and baicalin treatment+periodontitis group (P<0.01), and the serum level of IL-6 in baicalin treatment+periodontitis group was significantly lower than that in periodontitis group at week 6 and 8 (P<0.01). The serum level of IL-4 in periodontitis group was significantly lower than that in control and baicalin treatment+periodontitis group (P<0.01). The serum level of IL-4 in baicalin treatment+periodontitis group was significantly higher than that in periodontitis group at weeks 6 and 8 (P<0.01).CONCLUSIONThe pathogenesis of periodontitis is closely related to the imbalance of Th1/Th2 cytokines, characterized by increased serum level of IL-6 and the decreased serum level of IL-4. Baicalin plays a significant role in treating mouse periodontitis by decreasing the serum level of IL-6 and increasing the serum level of IL-4.

Periodontitis; Interleukins; Baicalin

R78

A

1000-4718(2011)03-0550-05

2010-10-21

2011-01-04

暨南大学本科生创新工程项目(No.cx10127)

△通讯作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.025