高粱原花青素的E S I-MS分析及其低聚体的R P-HP L C-MS/MS法分离鉴定

徐丽嫚，黄 曼，涂 世，陈 静，刘 睿*

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

高粱原花青素的E S I-MS分析及其低聚体的R P-HP L C-MS/MS法分离鉴定

徐丽嫚，黄 曼，涂 世，陈 静，刘 睿*

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

以高粱加工后的副产物——高粱外种皮为原料，采用电子喷雾离子化质谱(electrospray ionization-mass spectroscopy，ESI-MS)对ADS-17大孔树脂纯化的高纯度高粱原花青素(sorghum procyanidins，SPC)的组成进行分析，并通过反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)-质谱(RP-HPLCMS/MS)联用对Toyopearl HW-40凝胶色谱分离的SPC-5级分进行分离鉴定。结果显示：SPC为低聚体原花青素，包含有儿茶素/表儿茶素单体、原花青素二～六聚体；SPC-5由8种三聚体和1种二聚体组成。

高粱原花青素；凝胶色谱；电子喷雾离子化质谱(ESI-MS)；反相高效液相色谱-质谱联用(RP-HPLC-ESIMS/MS)；鉴定

reverse phase high-performance liquid chromatography-mass spectroscopy/mass spectroscopy (RP-HPLC-ESI- MS/MS)；identification

原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中广泛存在的一类属于双黄酮衍生物的天然多酚化合物，这类物质在酸性介质中加热，可降解和氧化产生红色花青素(cyanidins)，故称为原花青素[1]。原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，平均聚合度(degree of polymerization，DP)范围为2～15，平均分子质量为578～＞5000u，最简单的是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。根据聚合度的大小，通常将二～四聚体称为低聚体(proanthocyanidolic oligomers，OPC)，将五聚体以上的称为高聚体(p roa n th ocya n idolic polymers，PPC)。

随着原花青素与蛋白质、微生物、酶的反应活性及抗氧化、清除自由基等一系列化学反应机理被不断揭示，该类天然产物应用前景逐渐广阔，其中原花青素预防龋齿的作用引起越来越多的关注[2]，但研究还处于起步阶段，现有研究主要是采用提取液(混合物)或简单分级的级分进行，因此原花青素的分离和鉴定成为研究重点。原花青素的分离、纯化方法包括膜过滤或超滤、反渗透、溶剂萃取及色谱法等，其中色谱法是目前采用最多的方法。原花青素的柱色谱分离在色谱填料的选择上主要有 NKA[3]、ADS-17[4]、Toyopearl HW-40[5]、Sephadex LH-20[6-7]、PVP、HPLC-C18[4]、硅胶柱及聚酰胺等。原花青素的定性定量分析包括比色法和色谱法，结构表征主要采用HPLC-MS[8-10]、圆二色谱(circular dichroism，CD)[11]、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)[11-12]等。

我国高粱的栽培面积居世界第5位，产量居世界第3位，高粱外种皮中富含原花青素，这一富含原花青素资源未被有效利用。本研究拟采用乙醇溶液进行提取，通过ADS-17大孔树脂进行纯化获得目标产物高粱原花青素，通过Toyopearl HW-40凝胶色谱进行分离，结合质谱(mass spectroscopy，MS)和反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)-质谱联用(RP-HPLC-MS/MS)对高粱原花青素(sorghum procyanidins，SPC)和凝胶色谱分离的级分进行分离鉴定，为进一步探讨高粱原花青素分子质量大小及其组成与预防龋齿功效的关系建立研究方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱产于东北地区，干燥保存。

9 5%乙醇、盐酸、偏磷酸、亚硫酸氢钠、甲醇皆为AR级；乙腈、冰乙酸皆为HPLC级；Toyopearl HW-40(S)凝胶 日本Tosoh公司；ADS-17大孔树脂 天津南开和成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

检验碾米机 浙江台州市粮仪厂；RE52CS-1旋转蒸发器 上海亚荣有限公司；BETA2-8LD真空冷冻干燥机 美国Christ公司；BSZ-100自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂；1100液相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱外种皮原花青素的提取[13]

取一定质量的高粱，用检验碾米机碾磨和过筛(40目)后，得到高粱外种皮粉末。将粉末置于1000mL烧杯中，按照1:12(m/V)的料液比加入70%乙醇溶液、0.1g/100mL偏磷酸溶液、0.5g/100mL亚硫酸氢钠溶液，混匀，然后用薄膜封口后，放入80℃的水浴锅中直接加热90min，最后经过减压抽滤得到上清液。提取3次，将3次提取的上清液合并，真空浓缩得到SPC提取液。

1.3.2 SPC提取物的纯化

将预处理好的ADS-17大孔树脂装于玻璃层析柱(32cm×5cm)中，装柱过程中避免气泡产生。加入一定量的SPC提取液，先用10倍柱床体积的蒸馏水冲洗，直至流出液基本无色，去除水溶性的杂质。然后用40%乙醇溶液进行洗脱，从洗出颜色开始接收，至无色停止接收，最后用蒸馏水洗出乙醇。接收洗脱液真空浓缩，冷冻干燥得到SPC粉末，并计算得率。

测量SPC粉末纯度的方法采用盐酸-正丁醇法(Porter’s方法)[14]。按下列经验公式计算原花青素纯度。

PC纯度/%＝A÷(C×0.366÷7.2)

式中：C为原花青素质量浓度/(mg/mL)；A为波长546nm处的吸光度。

1.3.3 SPC的ESI-MS分析

称取冻干SPC粉末5mg，溶于5mL甲醇中，通过0.45μm滤膜过滤。将滤液通过直接进样模式进行MS分析。

MS分析条件：负离子模式，离子化方式为ESI-；扫描范围为50～2000m/z；干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min；喷雾压力为40psi；毛细管电压为3500V。

1.3.4 SPC凝胶色谱分离

称取0.1g SPC粉末，溶解于1mL甲醇中，经0.45 μm滤膜过滤。将滤液上样至Toyopearl HW-40凝胶柱(42cm×2cm)。以甲醇为流动相进行洗脱，流速为0.8mL/min，并用部分收集器进行收集，每10min收集一管，洗脱时间12h左右。最后用甲醇平衡色谱柱。每管接收液通过紫外扫描判定其物质类型，并记录每管在280nm波长处的吸光度，以管数为横坐标、吸光度为纵坐标作图。根据洗脱曲线，将相应部分合并、浓缩、冻干，得到各个级分的冻干粉末。

1.3.5 SPC-5级分的HPLC-MS/MS分析

称取冻干后凝胶色谱分离的SPC-5级分粉末5mg，溶于5mL甲醇中，通过0.45μm滤膜过滤，待进样。

HPLC-MS/MS分析条件：色谱柱为Symmetry C18(4.6mm×150mm)；质谱进样分流比为1:3；进样量为20μL；负离子模式，离子化方式为ESI-；扫描范围为50～2200m/z；干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min；喷雾压力为40psi；毛细管电压为3000V；PDA检测波长为280nm；柱温为35℃。流动相A为0.5%冰乙酸、B为乙腈；流速为1mL/min；梯度洗脱程序为：B在0min→18min由6%增大到25%，18min→20min由25%增大到60%，20min→25min为60%，25min→27min由60%减小到6%，27min→30min为6%。

2 结果与分析

2.1 SPC的提取及纯化

采用乙醇溶液提取高粱外种皮中的原花青素，ADS-17大孔树脂纯化后产物的得率为2.2%，经正丁醇-盐酸法测得纯化后原花青素的纯度为97.4%。

2.2 SPC的MS分析

图1 SPC全范围扫描质谱图Fig.1 Full scan negative ionisation mass spectrum of procyanidins extracted from sorghum episperm

ESI是一种软电离方式，它通常没有碎片离子峰，只有整体的分子离子峰，易于得到样品的分子质量信息。图1显示了含有m/z577.19、865.19、1153.22、1441.28、1730.20的分子离子，它们分别对应原花青素的二聚体(相对分子质量：578)、三聚体(相对分子质量：866)、四聚体(相对分子质量：1154)、五聚体(相对分子质量：1442)和六聚体(相对分子质量：1731)的分子离子峰(MH)－，同时也含有m/z285.28，它是由相对分子质量为289的儿茶素或表儿茶素脱去4个H+得到的。Jan等[15]在用反相高效液相色潽及电子喷雾离子化质谱研究巧克力中原花青素时，得到了m/z289.3、577.3、865.3、1153.2、1441.2、1729.1等原花青素准分子离子峰。Christian等[16]也曾证明了高粱中含有原花青素的四～九聚体，与本研究结果相似，因此可以初步判断纯化后SPC成分为二～六聚体的原花青素。

2.3 SPC凝胶色谱分离

由图2可知，部分收集接受每管可以通过紫外扫描初步判断其物质类型。原花青素的特征吸收光谱除了200nm附近苯环的E带吸收外，在紫外区主要以一个单峰的形式出现，其λmax在280nm附近；而黄酮类物质除上述特征外，其在350nm左右有个吸收峰。根据图2凝胶色谱分离结果可以将接收溶液分为1、2、3、4、5五个部分，依次标记为SPC-1、SPC-2、SPC-3、SPC-4、SPC-5，通过紫外扫描后可判断出SPC-1为平衡柱子后残留的溶液，SPC-2疑为黄酮类化合物，SPC-3、SPC-4和SPC-5为凝胶色谱分离SPC的3个原花青素级分。

图2 SPC的Toyopearl HW-40凝胶色谱分离图Fig.2 Chromatogram of SPC on Toyopearl HW-40 resin column

2.4 SPC-5级分的HPLC-MS/MS分析

图3 SPC-5的HPLC-MS分析中的色谱图Fig.3 HPLC-MS chromatogram of SPC-5

从图3可以看出，在所采用的色谱条件梯度洗脱下，SPC-5中的主要物质能够分开。

图4 不同保留时间的质谱图(A)及主要分子离子的二级质谱图(B)Fig.4 Mass and MS-MS spectra at each retention time

从图4可以看出，当保留时间为1.7、2.3、7.7、8.7、10.2、10.7、11.4、14.7min时出现的分子离子均为m/z865.2，其主要的碎片离子是m/z847.3(M－18)、739.2(M－126)、711.2(M－152-2H)、695.2(M－152－18)、577.2(M－288)、575.2(M－288－2H)、451.2(M－288－126－2H)、407.1(M－288－152－18)、289.1(M－576)、287(M －577－2H)。

由表1可知，m/z575.2、289.1、287.0均由QM cleavage分子间的断裂产生；m/z847.3是通过失去一分子水产生的；m/z2739.2、451.1是通过HRF反应失去一分子间苯三酚得到的；m/z695.2和m/z407.1由RDA反应产生，m/z695.2为发生RDA反应后失去一分子水产生。此结果与Falleh等[17]研究松叶菊属的植物中原花青素三聚体碎片离子(m/z847、695、739、577、425、289)及Karonen等[10]的研究结果相符合，说明SPC-5主要是原花青素的三聚体，可见在所采用的凝胶色谱分离条件下，将原花青素三聚体从SPC混合物中有效分离出来。HPLC-MS/MS分析结果显示，所采用的梯度洗脱条件能有效的将原花青素三聚体的8个异构体分离。

表 1 原花青素三聚体(m/z 865，即[M－H]-)在二级质谱中的主要分子离子Table 1 Major molecular ions of procyanidin trimer (m/z 865 [MCH]-) in MS-MS spectra

此外，图4中保留时间为8.1min的MS中的分子离子m/z576.4为原花青素二聚体以及MS/MS中的主要碎片离子m/z407.1(M－152－18)、289.1(M－288)。其中m/z407.1是通过HRF反应失去一分子间苯三酚，进一步脱水形成，m/z289.1是通过分子间裂解得到的。Karonen等[10]曾研究得出松树皮中原花青素二聚体的碎片离子为m/z286.9、289.0、407.2、425.2、451.0，樊金玲等[18]研究沙棘籽原花色素发现二聚体的主要碎片离子为m/z425、407、287、289、451、441、423等，研究的结果皆与本研究得到的结果相似，证实SPC-5中的1种二聚体被分开。

3 结 论

3.1 采用乙醇溶液提取高粱外种皮中的原花青素，ADS-17大孔树脂纯化后产物的得率为2.2%，经正丁醇-盐酸法测得纯化后原花青素的纯度为97.4%。

3.2 通过MS分析SPC含有儿茶素/表儿茶素单体、原花青素二～六聚体。说明通过ADS-17大孔树脂纯化的目标产物是由聚合度小于6的低聚体组成。证明高粱外种皮可以作为制备高活性低聚原花青素的原料，不仅提高了高粱的经济价值，同时也可以得到大量原花青素广泛用于医疗、食品以及日用化学品行业，也为后期原花青素结构与功效的研究提供理论依据。

3.3 通过Toyopearl HW-40凝胶色谱，纯甲醇作为流动相，流速为0.8mL/min时，SPC混合物能够得到很好的分离，被分为SPC-1、SPC-2、SPC-3、SPC-4、SPC-5五个部分。HPLC-MS/MS分析结果显示SPC-5主要是由8种原花青素三聚体和1种二聚体组成，且级分中的不同异构体得到分离。这为进一步研究原花青素分子质量大小及组成与预防龋齿效果的关系提供参考。

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ESI-MS Analysis of Procyanidins from Sorghum Episperm and RP-HPLC-ESI-MS/MS Separation and Identification of Its Oligomers

XU Li-man，HUANG Man，TU Shi，CHEN Jing，LIU Rui*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The composition of high-purity procyanidins purified by ADS-17 macroposours resin chromatography from sorghum episperm as a byproduct of sorghum processing was analyzed by electrospray ionization- mass spectroscopy(ESI-MS). Fraction SPC-5 separated from the procyanidins by Toyopearl HW-40 resin chromatography was identified by RP-HPLC-ESI-MS/MS. The high-purity procyanidins were found to be procyanidolic oligomers, including catechin/epicatechin monomers, dimmers, trimers, tetrames, pentamers and hexamers. SPC-5 consisted of 8 trimers and 1 dimmer.

sorghum procyanidins；gel chromatography；electrospray ionization-mass spectroscopy (ESI-MS)；

TS210.9

A

1002-6630(2011)20-0221-05

2011-06-29

华中农业大学优硕培植项目/中央高校基本科研业务费专项(201010)

徐丽嫚(1987—)，女，硕士，研究方向为食品科学。E-mail：19870906manman@sina.com

*通信作者：刘睿(1969—)，男，副教授，博士，研究方向为功能食品及农副产品深加工。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn