响应面分析法优化闪式提取胡柚皮中黄酮类化合物工艺

韩 帅，李淑燕，陈芹芹，李 珊，倪元颖*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

响应面分析法优化闪式提取胡柚皮中黄酮类化合物工艺

韩 帅，李淑燕，陈芹芹，李 珊，倪元颖*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

以胡柚皮为原料，采用闪式提取技术提取胡柚皮中黄酮类化合物。在单因素试验基础上，采用响应面法对提取溶剂浓度、料液比、提取时间进行优化。结果表明，溶剂体积分数、提取时间、液料比对黄酮提取率的影响比较显著，最佳工艺条件为乙醇溶液体积分数78%、液料比31:1(mL/g)、提取时间95s，由此得到的柚皮黄酮提取率为4.37%。闪式提取法是一种快速有效的柚皮黄酮的提取方法。

胡柚皮；闪式提取；黄酮；响应面

常山胡柚(Citrus Chang shan-huyou Y.B. Chang)是常山特有的柑橘地方品种，为芸香科植物柚[Citrus grandis(L.) Osbeck]与甜橙[Citrus sinensis (L.) Osbeck]的杂交品种，已有近百年的栽培历史[1]。2009年仅浙江常山县胡柚种植面积就达到了10.5万亩，产量达到了13.6万吨。胡柚富含多种营养活性物质，且风味独特，胡柚皮约占整个果重的30%，其中富含了丰富的香精油，果胶，黄酮类化合物和色素等成分，是一种宝贵的食物资源[2-3]。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的一类天然产物，其在抗氧化[4]、预防心血管疾病[5]、抗菌[6]、抗肿瘤[7]等方面展现了良好的生物活性，被广泛应用于制药和食品行业。胡柚皮作为下脚料常常得不到利用被丢弃，造成了资源的浪费，提取其中富含的黄酮类物质是对柚果皮综合利用的有效途径之一，具有潜在的开发利用价值和可观的经济效益。

闪式提取技术是一种新兴的天然产物提取技术，其依靠机械剪切力和超速动态分子渗透作用，在室温及溶剂存在下数秒内将植物组织破碎至细微颗粒，并使有效成分达到组织内外平衡，实现提取目的[8]。闪式提取技术能最大限度的避免植物有效成分受热破坏、具有溶剂用量小、提取时间短、效率高、处理量大、安全可靠等特点[9]。

本研究采用闪式提取法提取胡柚皮中的总黄酮，结合中心旋转回归试验(central composite design，CCD)和响应曲面(RSM)分析方法对影响胡柚皮总黄酮提取率的主要因素进行分析，从而确定闪式提取的适宜工艺，为规模化提取柚皮黄酮、开发新产品以及综合利用胡柚皮提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的常山胡柚购于北京。将胡柚果皮剥下后用清水洗净，在室内晾至24h后切成约0.2cm×0.2cm×0.2cm的小块，放入热风干燥箱40℃烘干12h，用破碎机粉碎至粉末，过40目筛后备用。

NaNO2、AL(NO)3、NaOH、乙醇、正己烷等(均为分析纯) 北京蓝弋化工公司；芦丁对照品(质量分数≥91.7%) 中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

BP221S精密电子天平 德国Satorious公司；RE-52A旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；UV757CRT紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Hitachi Himac CR22g高速冷冻离心机 日本日立株式会社；JHBE-50S闪失提取器 河南金鼐科技发展有限公司；WKX高速粉碎机 青州市精诚机械有限公司；S22-2恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制及标准曲线的建立

参照文献[10]方法配制标准溶液并绘制标准曲线：准确称取减压干燥至质量恒定的芦丁标准品25mg，用无水乙醇溶解定容于25mL容量瓶中，摇匀，得到1mg/mL的芦丁标准溶液，分别吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于25mL容量瓶中，分别加入0.8mL 5% NaNO2溶液1mL，摇匀，静置6min，再加入0.8mL 10% Al(NO3)3摇匀，放置6min，然后再加入10mL 1moL/L NaOH溶液，摇匀显色，以蒸馏水定容至刻度，静置15min。以零管为空白，光程1cm，在波长510nm处测定各容量瓶溶液的吸光度，以吸光度(A)为纵坐标、质量浓度(C)为横坐标，得到回归方程C=6.1225A－0.0263，R2=0.9998。

1.3.2 样品中黄酮含量的测定

准确称取柚皮粉10.0g，放入三角瓶中，加入一定体积分数的乙醇溶液室温下浸泡，磁力搅拌5min，采用闪式提取器在120V电压(r=3500r/min)条件下，提取一定时间，提取完成后，转移至离心机中，在转速4000r/min条件下离心20min，收集上层清液，将滤渣重复上述过程提取若干次。合并收集的清液，减压浓缩(t≤50℃)后采用30mL正己烷脱色两次，用提取体积分数的乙醇定容至100mL。取提取液1mL加入25mL容量瓶中，按

1.3.1节所述方法测定其在波长510nm处的吸光度，然后按照下式计算胡柚皮中黄酮类化合物的提取率。

式中：n为提取溶液的稀释倍数；C为柚皮提取液的黄酮质量浓度/(g/mL)；V为提取液的体积/mL；m为原料的质量/g。

1.3.3 闪式提取工艺试验设计

1.3.3.1 提取溶剂的选择

准确称取柚皮粉末4份，每份10.0g，分别采用无水甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯各150mL溶解，经闪式提取60s后，按1.3.2节所述方法完成吸光度的测定，计算不同溶剂时的柚皮黄酮提取率。

1.3.3.2 试验设计

首先进行单因素试验，选取溶剂体积分数、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，以柚皮黄酮提取率为指标。各因素水平见表1。

表1 单因素试验因素水平Table 1 Factors and levels in single-factor design

1.3.3.3 CCD优化试验设计

表2 响应面三因素五水平试验设计Table 2 Factors and levels in response surface analysis

采用Design Expert软件，采用CCD[11]建立数学模型，以溶剂体积分数X1、液料比X2和提取时间X3三个因素为自变量，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX对自变量进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长。以柚皮黄酮提取率为响应值，建立回归方程模型。由此求出影响因素的一次效应，二次效应及交互效应，实现对柚皮黄酮提取工艺优化，并做响应面法分析。中心复合试验各因素和水平见表2。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

图1 不同提取溶剂对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of solvent type on extraction efficiency of flavonoids

由图1可知，采用无水甲醇和无水乙醇作为提取溶剂，提取效果更加理想，而丙酮和乙酸乙酯做溶剂，黄酮提取率相对较低。从提取率上来看，甲醇提取率较乙醇略高，但经多重比较看，甲醇和乙醇的提取率并不存在显著性差异，但考虑到甲醇的毒性以及易对环境造成的污染，从使用安全和环保的角度考虑，选择乙醇作为提取胡柚皮黄酮的提取试剂。

2.2 溶剂体积分数对柚皮黄酮提取率的影响

图2 溶剂体积分数对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of flavonoids

在液料比20:1(mL/g)、提取时间60s、提取1次的条件下，乙醇溶液体积分数对胡柚皮黄酮提取率的影响如图2所示。结果表明，随着乙醇溶液体积分数增加，黄酮提取率也随之增大，当乙醇溶液体积分数达到80%时，柚皮黄酮的提取率最高，达到了3.82%。之后随着乙醇溶液体积分数增高提取率逐渐下降。经多重比较可知，各点之间的黄酮提取率差异显著。提取液中乙醇含量越高，溶剂极性越低，黄酮为弱极性分子，根据相似相溶原理，溶液极性与黄酮极性相近从而有利于黄酮的析出，黄酮提取率达到最高[12]，低于80%时柚皮中的黄酮化合物并未完全浸出，体积分数高于80%时，渗透压增大，一些脂溶性物质的溶解度增加，影响了黄酮类物质的溶解。最终选定乙醇溶液体积分数为80%。

2.3 液料比对柚皮黄酮提取率的影响

图3 液料比对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of liquid/material ratio on extraction efficiency of flavonoids

在乙醇溶液体积分数80%、提取时间60s、提取1次的条件下，料液比对柚皮黄酮提取率的影响如图3所示。结果表明随着液料比的增大，柚皮黄酮的提取率也逐渐增大，在液料比在15:1～30:1时，黄酮的提取率增大的较快，当液料比大于30:1时，增长延缓，并呈现出下降趋势。这是由于一定量的柚皮粉，溶剂用量的增加可以增加柚皮粉与提取溶剂的接触面积，增大固液浓度差，有利于扩散速度的提高[13]。当液料比达到一定程度时，继续增大液料比，固液浓度差增幅不太明显，从而提取率增势趋于和缓，过多的提取溶剂反而会使提取率降低，并且不利于试剂的节约，增加后续的浓缩过程的工作量，因此选定提取的液料比为30:1。

2.4 提取时间对柚皮黄酮提取率的影响

图4 提取时间对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency of flavonoids

在乙醇溶液体积分数80%、液料比30:1、提取1次的条件下，提取时间对柚皮黄酮提取率的影响如图4所示。结果表明，由于黄酮析出是一个动态的过程，从提取开始到提取90s，提取率显著增加，然后出现提取率随时间延长反而缓慢降低的趋势。这可能是因为闪提过程中由于刀头剪切力的作用产生了大量的热，随着提取时间的延长，溶液温度升高很快。当达到一定温度时，黄酮类化合物易发生氧化作用，进而导致柚皮中黄酮化合物结构遭到破坏而使黄酮提取率降低。为防止柚皮黄酮化合物长时间受热发生结构变化，影响产品的纯度和质量，并提高提取效率，可选择90s作为提取黄酮的最佳时间。

2.5 提取次数对柚皮黄酮提取率的影响

图5 提取次数对黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of number of repeated extraction on extraction efficiency of flavonoids

在乙醇体积分数80%、液料比30:1、提取时间90s的条件下，提取次数对柚皮黄酮提取率的影响如图5所示。结果表明，随着提取次数的的提高，柚皮提取液中残留的黄酮含量逐渐降低，经过两次提取后，继续提高次数，黄酮提取率增加不明显，这说明提取两次已经提取的比较完全，从节约试剂和减小后续浓缩环节工作的角度考虑，闪式提取的提取次数确定为两次。

2.6 黄酮类化合物提取工艺回归模型的建立及方差分析

表3 响应面分析试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

表3给出了响应面法优化闪式提取柚皮黄酮工艺的结果，采用Design Expert软件，选定CCD模型，对试验设计中各组的黄酮提取率进行回归分析，得到回归方程：

式中：Y为柚皮黄酮提取率；x1、x2、x3分别为溶剂体积分数、料液比、提取时间3个自变量的编码值。

模型的方差分析结果见表4。模型的F值为76.39(P＜0.0001)，说明所选模型极为显著。失拟项P=0.0944＞0.05，失拟项差异不显著，方程对实验拟合程度较好。模型相关系数是0.9885，矫正决定系数为0.9756，说明该模型能解释98.85%的响应值变化，仅有1.15%的变异不能用此模型解释；而相关系数与校正系数接近，说明该模型的拟合度和可行度高，实验误差小，可以用于对闪式提取胡柚皮中黄酮化合物的工艺结果的分析和预测，能够充分描述各实验因素对实验指标的影响规律。

表4 回归模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

对模型进行模型系数的显著性检验，结果见表5。经Statistic 6.0软件处理后，可见二次多元回归方程的常数项极显著，一次项x1、x2、x3，二次项x22、x12、x32极显著(P＜0.0001)，交互项x2x3显著(P＜0.05)，其余不显著。依据方程中一次项t值的绝对值大小可知，因素主效应关系为液料比＞溶剂体积分数＞提取时间。

表5 回归方程模型系数的显著性检验Table 5 Significance of each coefficient in the fitted regression model

2.7 响应面分析

根据CCD模型建立的二次回归方程，固定一个因素在编码值0的水平，分析另外两因素对柚皮黄酮提取率的影响，利用Design Expert软件进行响应面分析，探讨各因素及其交互作用对响应值的影响。

结果表明，液料比固定在30:1时，在设定的提取时间范围内，随着溶剂体积分数的增高，黄酮提取率呈先升高后降低的趋势；而当溶剂体积分数在72%～82%范围内时，随着提取时间的延长，黄酮提取率呈现出相同的变化趋势，从变化速率来看，溶剂体积分数的主效应要大于提取时间，与统计学分析一致；当提取时间设定为90s时，料液比在27:1～32:1之间时，随着溶剂体积分数的增高，黄酮提取率先升高后降低，变化速率表明，料液比的主效应要大于溶剂体积分数，与统计分析相符。因此可知，在试验水平范围内，适当的增加提取液料比有利于黄酮提取率的增大，并可以节省提取时间。在各因素中，液料比和提取时间之间的交互作用最为显著。

2.8 工艺优化与验证实验

采用Design Expert软件完成优化，得到的优化结果为乙醇溶液体积分数78.37%、液料比31.15:1(mL/g)、提取时间94.50s，在此条件下胡柚皮黄酮的提取率达4.32%。

将提取工艺参数修正为乙醇溶液体积分数78%、液料比31:1(mL/g)、提取时间95s，进行验证实验，最终测得3次平行实验的黄酮提取率平均为4.37%，略高于Design Expert软件的预测值，由此可以认为实验模型选择合理，结果理想。

3 结 论

利用Design Expert软件，采用CCD模型，建立了柚皮黄酮提取率的二次多元线性回归方程：

优化出胡柚皮黄酮提取率的条件为乙醇溶液体积分数78%、液料比31:1(mL/g)、提取时间95s，最终所得到的柚皮黄酮提取率为4.37%。

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Response Surface Methodology as an Approach to Optimization of Flash-extraction of Flavonoids from Peel of Citrus Changshan-huyou

HAN Shuai，LI Shu-yan，CHEN Qin-qin，LI Shan，NI Yuan-ying*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The peels of citrus Changshan-huyou were used as the raw material to extract flavonoids by flash-extraction technology. Based on single factor experiments, extraction conditions such as solvent concentration, liquid/material ratio, and extraction time were optimized by response surface methodology. The results showed that each of the three extraction conditions affected flavonoid extraction significantly. The optimized conditions were as follows: 78% ethanol concentration, 31:1 liquid/material ratio, and 95 s extraction time, resulting in an extraction efficiency of 4.37% for flavonoids. As a conclusion, flashextraction is an effective and efficient method to extract flavonoids from peel of Citrus Changshan-huyou.

citrus Changshan-huyou peel；flash-extraction；flavonoids；response surface methodology

TS255.1

A

1002-6630(2011)10-0052-05

2010-07-23

韩帅(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为食品天然产物的提取与功能性质。E-mail：topaik@163.com

*通信作者：倪元颖(1960—)，女，教授，硕士，研究方向为天然产物的提取与功能性食品开发。E-mail：niyuanying@163.com