电子鼻对两种食源性致病菌在菌株水平上区分的研究

邓高燕，喻勇新，潘迎捷，刘 源，赵 勇

(上海海洋大学食品学院，上海201306)

电子鼻对两种食源性致病菌在菌株水平上区分的研究

邓高燕，喻勇新，潘迎捷，刘 源，赵 勇*

(上海海洋大学食品学院，上海201306)

利用基于金属氧化物传感器阵列的电子鼻技术对五株单增李斯特菌和五株副溶血性弧菌的挥发性代谢产物进行研究，结合主成分分析(PCA)和聚类分析(CA)等化学计量学方法对电子鼻原始数据进行统计学分析。结果显示，电子鼻模式识别技术能够很好地将五株单增李斯特菌的挥发性代谢产物图谱进行区分，而在同一技术条件下对五株副溶血性弧菌的挥发性代谢产物图谱只能进行部分区分，利用向这五株副溶血性弧菌的培养液中添加NaCl至饱和的方法，可以将五株菌完全区分开来，区分效果显著增强。实验表明利用电子鼻结合主成分分析和聚类分析技术对食源性致病菌在菌株水平上的区分和鉴定具有一定的可行性，有望将该技术开发成为一种快速、简便、无损的食源性致病菌新型检测分型方法。

电子鼻，副溶血性弧菌，单增李斯特菌，化学计量学方法，食品检测

近年来，由沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌等食源性致病菌引起的食品安全问题报道不断［1－4］。据WHO估计，全世界每年发生食源性疾病数达十亿人次，每年约有二百万儿童死于腹泻，其中66%以上是由细菌性致病菌所致［1］。因此，开发快速的致病菌检测技术成为保障食品安全的重要任务之一。目前常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要有分离培养鉴定法、生化鉴定法、酶联免疫吸附法(ELISA)等一些免疫学方法和基于DNA的一些分子生物学方法［2］。传统的以分离培养为基础的检测方法操作复杂，一般需要几天或者多达一周的时间，且对致病菌的检测特异性不高;免疫学方法特异性好、灵敏度高，但操作繁琐，时间长，对实验技能要求也很高［3］;分子生物学方法主要针对核酸进行检测，但其所用的仪器都比较昂贵，而且需要对样品进行细胞破壁提取核酸，过程复杂且会破坏样品。因此，从食品安全的关键问题出发，研究快速、简便、无损的食源性致病菌检测方法已迫在眉睫。近年来，国内外一些学者相继利用电子鼻对微生物进行了一系列的检测和区分研究。早在1997年，Gibson等［4］利用电子鼻技术在微生物属水平上成功地区分了纯培养条件下12种细菌和一种酵母菌的挥发性代谢产物。Pavlou等［5］率先利用含14根导电聚合物传感器的电子鼻技术对体外培养的两种细菌:梭状芽孢杆菌和脆弱类杆菌的挥发性代谢产物进行了研究，结果显示能够很好的在属水平上区分这两种细菌。Ritaban Dutta等［6］采用手持式的Cyranose 320电子鼻结合径向基函数网络技术对常见的感染眼睛疾病的六种细菌进行了检测和识别，在种水平上的准确区分率达到了98%。我们实验室已经利用电子鼻技术成功地检测了蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、缓慢葡萄球菌三种不同属的细菌在TSB培养液中的挥发性代谢产物，能够将不同属间细菌在TSB培养条件下所产生的气味信息区分开来［7］，同时对单增李斯特菌不同培养时间的培养液中挥发性代谢产物进行了检测，通过电子鼻技术能够很好的将不同培养时间的单增李斯特菌进行区分，并且发现该菌在生长8h后产生了特有的气味物质，为利用电子鼻等气味指纹技术检测微生物提供了有效的佐证［8］，之后检测了一株分离自南美白对虾的副溶血性弧菌经纯培养后产生的挥发性代谢产物，发现副溶血性弧菌经纯培养后产生了明显区别于空白纯培养液的挥发性代谢产物，表明电子鼻可以很好的应用于纯培养微生物的检测［9］。但是，关于利用电子鼻对同属同种不同株细菌间气味信息区分的研究还比较少。2000年，McEntegart等［10］应用电子鼻技术对两株大肠杆菌的挥发性气味进行了研究，但结果表明在该实验方法下利用主成分分析不能将这两株菌的气味很好的区分开来。本研究是在本实验室前人研究的基础上，进一步利用电子鼻技术，对同属同种不同株之间的单增李斯特菌以及副溶血性弧菌在TSB培养液中的挥发性代谢产物进行检测，以探讨应用电子鼻结合化学计量学方法在菌株水平上对食源性致病菌区分的可行性，并向样品中添加无机盐［11－12］，利用盐析作用来增加样品中挥发性代谢产物的浓度，以增强电子鼻对菌株水平气味信息的区分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

培养基 胰酪胨大豆肉汤(TSB)，其成分包括胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，购于上海中科昆虫生物技术开发有限公司，培养基配制好后经121℃高压湿热灭菌 20min;五株单增李斯特菌 Listeria monocytogenes ATCC7644、 Listeria monocytogenes ATCC13932、Listeria monocytogenes ATCC19112、Listeria monocytogene ATCC19117 与 Listeria monocytogenes ATCC19118，分别简称为:LM1、LM2、LM3、LM4与 LM5;五株副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus 1111、Vibrio parahaemolyticus 1112、 Vibrio parahaemolyticus 1113、Vibrio parahaemolyticus 1114与 Vibrio parahaemolytic us1115，分别简称为: VP1、VP2、VP3、VP4与VP5。

商品化的Fox－4000 Sensory Array Fingerprint(福克斯4000型气味指纹分析仪，电子鼻)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液制备 从细菌菌种纯培养的培养皿上挑取一环单菌落，接种于装有100mL TSB培养液的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min摇床培养12h后作为种子液。再分别定量吸取种子液1mL接种到装有100mL TSB培养液的 250mL三角瓶中，置于37℃、180r/min摇床上培养12～14h作为试样样品供E－nose检测，经分析细菌培养物的浓度在 108～109CFU/mL左右，最后将这些菌液作为实验样品供电子鼻检测。定量吸取2mL培养好的菌液分装到10mL的E－nose样品瓶中，每个样品做5个平行，每个实验重复3次。

1.2.2 含饱和 NaCl的五株副溶血性弧菌菌液制备

由于五株副溶血性弧菌菌液的气味可能不能被电子鼻很好的区分，因此向这五株菌菌液中添加固体NaCl至饱和，以增强其气味信息，达到较好的区分效果。定量吸取2mL培养好的菌液分装到10mL的E－nose样品瓶中，然后在每个样品中加固体NaCl至饱和，获得含饱和浓度NaCl的五株副溶血性弧菌菌液，每个样品做5个平行，每个实验重复3次。

1.3 检测方法

该电子鼻原始数据是以每根传感器信号的最大响应值为基础建立的特征向量矩阵，然后采用化学计量学方法进行聚类和统计分析。传感器所对应的检测方法及参数，详见参考文献［7］。本文采用主成分分析法(Principal Component Analysis，PCA)和聚类分析法(Cluster Analysis，CA)对样品的原始数据进行分析。

主成分分析主要是将传感器响应的特征向量矩阵进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后将分类结果以PCA散点图的形式展现出来［13－14］。其基本思想是将原来众多的变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量，同时根据实际需要从中取出几个较少的总和变量并尽可能多地反映原来变量的信息。聚类分析［15］是一类分类学与多元分析相结合的多元统计方法，它将电子鼻得到的特征向量矩阵置于一个多维空间中，按照空间关系的亲疏程度进行分类，即根据变量彼此不同的属性进行辨认，将具有相似属性的变量聚为一类，按“物以类聚”的原则将特性相近的变量或观察单位进行分类。本实验利用样品间欧氏距离的相似性对样品空间进行分类。

2 结果与分析

2.1 五株单增李斯特菌气味的电子鼻分析

2.1.1 主成分分析(PCA) 图1是对五株单增李斯特菌菌液样品气味进行电子鼻分析后获得的PCA图。传感器阵列进行主成分分析得到前两个主成分的贡献率分别为90.859%和7.954%，表明PCA分析结果图能够很好反映样品的整体信息。LM1～LM5分别为含LM1、LM2、LM3、LM4与LM5的气味信息。从图1可以看出每个样品的5个重复点能够很好的聚在一起形成一个个组群，表明实验样品的重复性很好;五株单增李斯特菌和空白TSB培养液的气味指纹在PCA图上能够明显的区分开来。

图1 五株单增李斯特菌在TSB培养液上的气味PCA分析

从生物分类学角度上比较，五株单增李斯特菌属于同种同属不同株的水平，它们的遗传信息基本相同，仅存在一定的差异，而这种较小的差异可能使不同细菌对培养基分解能力出现差别，从而造成其代谢产物不同。结合图1的分析结果也可以进一步表明，基于个体基因型的差别其产生的挥发性代谢产物存在的个体差异还是能够被电子鼻技术捕获到并进行区分，因此基于微生物的挥发性代谢产物的研究对单增李斯特菌在菌株水平上的区分是可行的也是有效的。

2.1.2 聚类分析(CA) 图2为五株单增李斯特菌菌液气味的聚类分析图，B1～B5为空白TSB培养液样品的五个平行，L11～L15、L21～L25、L31～L35、L41～L45与L51～L55分别为LM1、LM2、LM3、LM4与LM5五株菌菌液样品的五个平行。从图2中可以看出，30个样品被准确的聚为六类，空白TSB培养液与五株单增李斯特菌菌液都各自聚为一类，与PCA结果一致。表明五株菌在TSB培养液中产生的挥发性代谢产物存在的差异性，我们可以通过电子鼻技术在整体上展现出来。进一步表明电子鼻技术有足够的灵敏度区分这五株细菌。

图2 五株单增李斯特菌在TSB培养液上的气味CA分析

2.2 五株副溶血性弧菌气味的电子鼻分析

2.2.1 主成分分析(PCA) 图3是对五株副溶血性弧菌菌液样品气味进行电子鼻分析后获得的PCA图。前两个主成分的贡献率分别为 90.859%和7.954%，样品的整体信息被很好的反映了出来。

从图3中我们可以看出，五株副溶血性弧菌菌液与空白TSB培养液的气味指纹在PCA上不能够被很好的区分开。空白TSB样品的5个平行能够聚在一起，形成独立的区域;而副溶血性弧菌VP1、VP2与VP5三株菌的菌液气味信息有很多交叉的部分，表现在PCA上的气味指纹有很多相似的地方，不能够区分开来;同样副溶血性弧菌VP3与VP4两株菌的菌液气味指纹信息也有部分交叠在一起，区分效果较差。该实验结果表明，基于微生物的挥发性代谢产物的研究对副溶血性弧菌在菌株水平上的区分有一定的限制，不能将实验的五株副溶血性弧菌菌液的挥发代谢产物一一区分开来。

图3 五株副溶血性弧菌在TSB培养液上的气味PCA分析

2.2.2 聚类分析(CA) 图4为五株副溶血性弧菌菌液气味的聚类分析结果，图中B1～B5为空白TSB培养液样品的五个平行，V11～V15、V21～V25、V31～V35、V41～V45与 V51～V55分别为含 VP1、VP2、VP3、VP4与VP5五株菌菌液样品的五个平行。从图4中可以看出，30个样品被聚为三类;空白TSB培养液、含VP1、VP2、VP5菌菌液样品、含VP3、VP4菌菌液样品。利用聚类分析同样不能将实验的五株副溶血性弧菌液的挥发代谢产物完全区分开来，该结果与PCA图一致。表明五株副溶血性弧菌在TSB培养液中产生的挥发性代谢产物存在的差异性较小，不能通过电子鼻技术区分开来。

图4 五株副溶血性弧菌在TSB培养液上的气味CA分析

针对本次分析结果，在接下来的实验中，向这五株副溶血性弧菌的培养液中添加固体NaCl至饱和，因为无机盐的加入可以增强样品中离子强度，降低极性有机物在水中的溶解度即盐析作用［16］，进一步探讨电子鼻对这五株菌菌液气味信息区分的能力。

2.3 添加NaCl至饱和的五株副溶血性弧菌培养液气味的电子鼻分析

2.3.1 主成分分析(PCA) 图5是五株副溶血性弧菌培养液加固体NaCl至饱和后气味的电子鼻分析的PCA图。传感器阵列进行主成分分析得到前两个主成分的贡献率分别为97.205%和1.592%，同样表明PCA分析结果图能够很好反映样品的整体信息。从图5中我们可以看出，加NaCl之后检测的五株副溶血性弧菌菌液气味与空白TSB培养液的气味在PCA能够被很好的区分开。空白TSB样品的5个平行能够聚在一起，VP1、VP2、VP3、VP4与VP5五株菌的菌液各自的五个平行也能够很好的聚在一起，完全地区分开。

图5 添加NaCl至饱和的五株副溶血性弧菌在TSB培养液上的气味PCA分析

为了更好地探讨五株副溶血性弧菌的气味信息在加NaCl至饱和与未加时的区别，实验将电子鼻得出的两组数据进行了整合，如图6所示。其中，VP1、VP2、VP3、VP4、VP5与TSB是未加NaCl时的气味信息，VP1(A)、VP2(A)、VP3(A)、VP4(A)、VP5(A)与TSB(A)是加NaCl之后的气味信息。从图6中，我们可以很好的看出，未加NaCl时，五株副溶血性弧菌菌液气味与空白TSB培养液的气味在PCA图上不能够被很好的区分开，其中VP1、VP2、VP3、VP4四株菌菌液的气味信息有很多交叠在一起，只有VP5菌株的气味信息区别于其他菌株;在加盐之后，五株菌的气味信息可以很好的区分开来。

本次实验可以得出，基于电子鼻技术对副溶血性弧菌在菌株水平上的区分虽有一定的限制，不能将实验的五株副溶血性弧菌菌液的挥发代谢产物一一区分开来，但可以通过添加无机盐的方法，增加菌液挥发性物质浓度，来达到完全区分的目的。

图6 未加NaCl与添加至饱和时五株副溶血性弧菌在TSB培养液上的气味PCA分析

2.3.2 聚类分析(CA) 图7为添加固体NaCl至饱和的五株副溶血性弧菌菌液气味与空白TSB培养液的气味的聚类分析结果，图中B1～B5为空白TSB培养液样品的五个平行，V11～V15、V21～V25、V31～V35、V41～V45与 V51～V55分别为含 VP1、VP2、VP3、VP4与VP5五株菌样品的五个平行。从图7中可以看出，空白TSB培养液的五个平行可以聚在一起，VP1、VP2、VP4、VP3与VP5五株菌液样品的各自五个平行也能够很好的聚在一起。从该图中信息我们可以得出，利用聚类分析可以将空白TSB、VP1、VP2、VP4、VP3与VP5五株菌液样品的气味信息很好的区分开来。该结果与不添加NaCl样品的五株菌聚类分析结果相比，很大程度上增强了区分效果，同时也验证了添加无机盐引起的盐析作用可以提高样品中的挥发性物质的浓度，提高传感器对样品的区分度。

图7 添加NaCl至饱和的五株副溶血性弧菌在TSB培养液上的气味CA分析

3 结论与讨论

基于不同微生物个体在生长的同时会根据各自的特异性产生一些挥发性代谢产物(Microbial Volatile Organic Compounds，MVOCs)，人类可以利用此类物质了解微生物生命活动本质规律［17］。在生物学分类上，不同微生物个体的MVOCs往往不同，它们一般具有种属特征，因此这些气味物质以及由它们组成的气味指纹图谱可以潜在的被用来作为微生物鉴定与检测的依据［18－19］。近年来也有很多研究报道了基于气味指纹技术在微生物检测中的应用，正如文章引言部分所述，电子鼻在细菌属、种、株水平上都有一系列的研究。现有的结果显示，电子鼻可以有效地区别属、种水平上的细菌经培养产生的挥发性代谢产物，但是在菌株水平上的研究还未有很好的研究结果，这可能是由于菌株水平上细菌在遗传学上的亲缘关系较近，难以将它们在生长过程中所产生的代谢物质进行区分，也有可能是菌株水平上细菌产生特有的挥发性物质较少，难以被仪器检测出来。

在已报道的实验中，由于被检测样品的浓度低，信号弱，有的研究者提出一些增大信号的方法，例如胥勋涛等人［20］研究出的一个结合气体浓缩的电子鼻伤口病原菌检测系统，利用该系统对实验室培养病原菌的稀释顶空气体进行测试，可以极大地提高电子鼻对伤口病原菌的区分能力。也有研究人员通过向样品中添加无机盐，利用盐析作用来提高检测率，Fisher［21］在分析酒中污染物时，采用加入无机盐的方法进行研究，分析结果高出了25%。本研究针对食源性致病菌，特别针对含盐量高的腌制食品，含盐量高，所以采用加盐的方法来增强信号，结果表明，该方法的效果很好，可以达到完全区分的目的，有望应用于实体样品的检测中。

本次实验较之前的文献所报道结果相比，对细菌在菌株水平上的区分有较大的突破性进展，在以后的实验中还将会结合气质联用技术对不同菌株在培养过程中产生的挥发性物质进行定性分析。综上所述，电子鼻技术对食源性致病菌在菌株水平上的区分和鉴定具有一定的可行性，有望将该技术开发成为一种快速、简便、无损的食源性致病菌新型检测方法。

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Recognition of two food－borne pathogens at strain level by using electronic nose technology

DENG Gao－yan，YU Yong－xin，PAN Ying－jie，LIU Yuan，ZHAO Yong*
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

An electronic nose(E－nose)based on metal oxide sensor was used to detect the volatile metabolites from two pathogenic bacteria at the strain level.E－nose coupled with several chemometrics methods such as principal component analysis(PCA)and cluster analysis(CA)were used for statistical analysis.Qualitative discrimination results showed that the volatile metabolites of these five strains of Listeria monocytogenes(LM) could be distinguished by PCA pattern respectively，while the volatile metabolites of Vibrio parahaemolyticus(VP) under the same condition could only be partly distinguished.However，when adding NaCl to each five culture solution of VP until saturation，the volatile metabolites of these five strains VP could be distinguished obviously.The application of E－nose had a certain potential for distinguishing and identifying food－borne pathogens at the strain level，and this technology could be developed as a rapid and non－destructive method for detecting food－borne pathogens in the future.

electronic nose(E－nose);Listeria monocytogenes;Vibrio parahaemolyticus;chemometrics methods; food detection

TS207.4

A

1002－0306(2011)12－0142－05

2011－08－18 *通讯联系人

邓高燕(1986－)，女，在读硕士研究生，从事食品微生物快速检测方面的研究。

上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字2005第4－2号，2006第10－5号，2009第6－1号);上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704);上海海洋大学青年基金(A－2501－10－011506);国家自然基金项目(30901125)。