产丁二酸杆菌诱变菌株的发酵特性及其代谢通量研究

伍亚华，石亚中，吴珊珊

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030)

产丁二酸杆菌诱变菌株的发酵特性及其代谢通量研究

伍亚华，石亚中，吴珊珊

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030)

以产丁二酸杆菌为出发菌株，利用紫外线诱变，经氟乙酸、丙烯醇两种方法筛选突变株。研究了诱变菌株发酵时不同的发酵条件对发酵产物产量的影响及代谢通量。实验表明，在CO2充足条件下，接种量为6%、摇床转速为200r/min、发酵72h时，目标产物丁二酸产量最高，达7.87g/L，而副产物的产量不高。代谢通量结果表明，原始菌株的葡萄糖利用率很低，经过诱变筛选以后，丁二酸代谢通量提高了4.1%。

产丁二酸杆菌，发酵，代谢通量

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618);斜面培养基 TSA培养基;发酵培养基(g/L) 葡萄糖50，酵母提取物10，TSB 5，KH2PO41，(NH4)2SO42，MgCl20.5，NaCl 0.5，CaCO350;固体培养基(g/L) 葡萄糖10，酵母抽提物5，NaCl 1，MgCl2，CaCl21.5，Na2HPO40.46，NaH2PO40.27，MgCO310，琼脂粉 14，pH7.2;氟乙酸平板培养基(g/L)TSA 33.4，氟乙酸5，调节pH 7.0左右，115℃灭菌20min;丙烯醇平板培养基(g/L)TSA 33.4，0.5%(W/V)丙烯醇，调节 pH 7.0左右，115℃ 灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 诱变筛选

1.2.1.1 氟乙酸平板诱变筛选 挑取适量已活化的原始出发菌株于9mL无菌水中混匀制成菌悬液，然后在紫外线下进行诱变3min，均匀涂布到氟乙酸各梯度平板上，35℃恒温箱中倒置培养48h。

1.2.1.2 氟乙酸－丙烯醇诱变筛选 挑取适量氟乙酸筛选得到的菌株于9mL无菌水中混匀制成菌悬液，然后在紫外线下进行诱变3min，均匀涂布到丙烯醇各梯度平板上，35℃恒温箱中倒置培养48h。

1.2.2 突变株摇瓶条件下发酵实验 取Actinobacillus succinogenes诱变菌株进行摇床条件下的发酵。用无菌水洗下孢子，取1mL突变菌株孢子悬液接种于发酵培养基内，置摇床32℃，一定条件下培养，发酵，测丁二酸产量。每个发酵条件用3个摇瓶平行实验。发酵液过滤后用于测定丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸、乙醇和葡萄糖含量。所有结果均取3次测定的平均值。

1.3 产物检测

1.3.1 生物量测定 恒重法。

1.3.2 残糖检测 DNS法［13］。

1.3.3 发酵产物分析 用离子排斥 HPLC检测［14］，Waters1512二元泵，Waters 2414RI检测器，Breeze色谱工作站，Aminex HPX－87H离子色谱柱(300mm× 7.8mm，9μm)，流动相10mmol/L硫酸，柱温55℃，流速0.5mL/min，进样量10μL。

1.4 代谢通量分析

在菌株相关酶活分析及代谢产物精确检测的条件下，结合丁二酸放线杆菌的主代谢途径，推测其代谢过程，并利用拟稳态假设的方法，可求出各个途径的代谢通量。

根据Zeikus的研究建立代谢网络［15］和代谢通量分析理论，假设所有中间代谢产物均满足拟稳态假设，得出质盘平衡方程;如表1所示，包括12个反应，其中涉及13个代谢通量，方程组的自由度为6，通过测定发酵液中的丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸和葡萄糖的浓度，求得比摩尔浓度变化率，得到不同时间的菌体、丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸的生成速率和葡萄糖的消耗速率，通过最小二乘法确定其他未知代谢通量［16］。

表1 生化反应

表2 代谢通量方程及其他条件方程

2 结果与分析

2.1 Actinobacillus succinogenes的发酵研究

2.1.1 不同气体条件对发酵产物的影响(发酵72h)

表3为Actinobacillus succinogenes在不同气体条件下发酵产物的产量。从表3可以看出，不同气体条件下，Actinobacillus succinogenes的发酵产物产量有所不同。其中丁二酸产量受气体条件影响较大，在二氧化碳充足时，丁二酸的产量最高，这对于培养Actinobacillus succinogenes有启示作用。

发酵过程中的副产物乳酸、乙酸也受到气体条件的影响，在N2充足时，产物乳酸和乙酸的产量较多，这可能是由于极端的厌氧条件所导致的。

表3 不同气体条件下代谢产物的产量(g/L)

CO2充足时，细胞可以发酵产生丁二酸以消耗还原力;当氧气充足时细胞可以通过三羧酸循环消耗的还原力促进细胞生长，当细胞面临极端的厌氧条件时，细胞内的乳酸脱氢酶及乙醇脱氢酶作用，使还原力用来生成乳酸和乙醇，这样可以保证细胞生长的顺利进行。

2.1.2 CO2充足情况下不同发酵时间对发酵产物的影响 表4为在CO2充足情况下在不同的发酵时刻，Actinobacillus succinogenes主要发酵产物的比较。

表4 不同时间条件下发酵液成分对照表(g/L)

从表4可以看出，发酵72h时，丁二酸的产量相对较高，乳酸和乙醇的产量在一定的范围内随发酵时间的延长而增加，而其他副产物甲酸、乙酸都比其他时刻要低。所以综合上述因素，一般认为，对于Actinobacillus succinogenes发酵生产丁二酸来说，72h是比较合适的发酵时间，此时，目标产物丁二酸的产量较高，而副产物的产量不高。

2.1.3 接种量对发酵的影响(发酵72h) 图1为发酵时间为72h条件下，接种量对发酵产物产量的影响。接种量的不同，使得摇瓶中的剩余空间不同，振荡培养中的发酵液流体性质也不同，因而是比较重要的影响因素。由图1可知，在本实验条件下，接种量与发酵产丁二酸的量不存在正比关系，当接种量为10%时，丁二酸产量最大，为8.84g/L，接种量增加时，产酸水平开始下降。

图1 接种量对发酵产物的影响

2.1.4 摇床转速对乳酸发酵的影响(发酵72h) 图2为在为发酵时间为72h条件下摇床转数对产酸的影响。由图2可知，摇床转数对产酸影响较为显著，其中200r/min对目标产物丁二酸的产酸最为有利。转速过小，摇瓶通气量不足，影响发酵产物丁二酸的累积;转速过大，丁二酸的累积量并没有明显变化。

图2 摇床转速对发酵产物的影响

2.2 代谢通量分析

在二氧化碳富集条件下，选取 Actinobacillus succinogenes及其氟乙酸诱变株和丙烯醇复合诱变株，发酵72h，测量发酵液中葡萄糖、甲酸、乳酸、乙酸、丁二酸和乙醇的比消耗速率，并根据代谢分析理论解出代谢方程，得出丁二酸发酵过程几个关键步骤的代谢通量。

由图3可以看出发酵中期细胞代谢通量值，对于原始出发菌株而言，葡萄糖的摩尔转化率为31.8%，甲酸、乙酸、乙醇、乳酸的生成通量分别为25.4、25.3、23.0、6.8，处于较低的水平。

氟乙酸筛选菌株的丁二酸产量相对于原始菌株有所提高，一些副产物的量也有提高，特别是甲酸、乙醇的含量提高较为明显，这可能是由于突变株中丙酮酸羧化酶较低造成了副产物的增加。氟乙酸丙烯醇复合筛选菌株的丁二酸产量有了很大的提高，并且乙醇的产量大幅度降低，乙醇通量相对降低，副产物减少，使得丁二酸的代谢通量提高了4.1%。

3 结论

Actinobacillus succinogenes发酵时，在CO2充足条件下，接种量为6%、摇床转速为200r/min、发酵72h时，目标产物丁二酸产量最高，达7.87g/L，而副产物的产量不高。通过对Actinobacillus succinogenes出发菌株、氟乙酸诱变株以及氟乙酸丙烯醇复合诱变株进行代谢通量分析，结果表明，原始菌株的葡萄糖利用率很低，经过诱变筛选以后，葡萄糖的利用率有所提高，丁二酸产生通量提高了4.1%(此处代谢通量其实就是指碳代谢的流量，假定葡萄糖为100的情况下，转化为丁二酸的转化率越高，通量越大)，副产物在一定的程度上减少。

图3 代谢网络中的通量分布

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Study on the fermentation condition of production succinic acid strains and metabolic flux analysis with ultraviolet induced

WU Ya－hua，SHI Ya－zhong，WU Shan－shan
(Department of Biotechnology and Food Engineer in Bengbu College，Bengbu 233030，China)

Screening of high production succinic acid strains and metabolic flux analysis with ultraviolet were studied.The production of succinic acid of the wild strain was investigated under different gas conditions and fermentation time.Screening experiments of the wild strain were performed by using ultraviolet.It was found that the production of succinic acid of the mutant was measured to be 7.87g/L，which was higher than that of the wild strain，when culturing for 72h with enough CO2.Moreover，the yield of byproduct of the mutant was low.Results of metabolic flux analysis demonstrated that the utilization ratio of glucose of the mutant，compared to the wild strain，increased by 4.1%.

Actinobacillus succinogenes;fermentation;metabolic flux

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0233－04

丁二酸是一种二羧酸，为三羧酸循环的中间产物，同时也是厌氧代谢的发酵产物之一，在医药、食品、发酵、纺织等行业被广泛的应用［1－3］。当前，大部分的丁二酸是通过化学法生产的。近年来，利用微生物菌种，以农业产物玉米、木薯等为基本原料，发酵生产丁二酸已成为有机酸发酵研究的热门课题［1，4］。丁二酸作为三羧酸循环的中间体，也是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌累积产物［5－6］。产生丁二酸的微生物包括丙酸产生菌、典型的胃肠菌、瘤胃菌等［7－8］。Actinobacillus succinogenes是利用糖类物质代谢产生丁二酸的瘤胃菌的代表［9－10］，是工业上生产丁二酸的一种高效菌种。Actinobacillus succinogenes发酵生产丁二酸的发酵产物为多种酸的混合物［11－12］。本研究以产丁二酸放线杆菌为出发菌株，利用紫外线对出发菌株进行诱变，通过氟乙酸、丙烯醇两种方法筛选，获得复合突变菌株，并对其发酵条件和代谢通量进行了研究。

2010－09－25

伍亚华(1972－)，男，讲师，硕士研究生，研究方向:农产品加工与贮藏专业。

蚌埠学院优秀人才资助项目(蚌埠学院字［2008］2号)。