HPLC内标法同时测定十三香中胡椒碱和6-姜酚的含量

林先哲，郭墨婷，吴珍菊，吕梦莎，黄雪松

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632)

HPLC内标法同时测定十三香中胡椒碱和6-姜酚的含量

林先哲，郭墨婷，吴珍菊，吕梦莎，黄雪松*

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632)

目的:建立快速、准确并同时测定十三香中姜酚和胡椒碱含量的方法。方法:采用 HPLC法，色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长280nm。结果:内标法与标准曲线法的测定结果一致;胡椒碱在5～160μg/mL、姜酚和姜酚肟在20～640μg/mL时，峰面积与浓度呈良好线性关系;相关系数分别为0.9995、0.9997、0.9995。十三香中胡椒碱和姜酚的含量分别为:20.23、4.33mg/g。结论:用姜酚肟做内标测定产品中姜酚和胡椒碱的方法既不用重复做标准曲线，又可同时测定两种成分的含量。

胡椒碱，姜酚肟，姜酚

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯) 购自迪玛科技;水 经过滤后的纯净水;胡椒碱 购自西安华萃生物技术有限公司，纯度为98%;6-姜酚标样 购自日本WAKO公司，纯度大于98%;6-姜酚肟标样实验室自制［16-17］，经归一化法测定其纯度＞95%;样品 某市售十三香粉。

LC-20AT高效液相色谱仪(配备SPD-M20A光电二极管阵列检测器、Class-vp色谱工作站) 日本岛津公司;超声波振荡器 江苏宏华仪器厂; SK3310LHC水浴恒温振荡器 上海科导超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胡椒碱标准溶液的配制 精确称取胡椒碱标准品0.016g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，配成160μg/mL的标准储备液。精确量取该储备液，倍比稀释成160、80、40、20、10、5μg/mL的系列标准溶液。

1.2.2 6-姜酚标准溶液的配制 精确称取6-姜酚标准品0.064g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，配成640μg/mL的标准储备液。精确量取该储备液，倍比稀释成640、320、160、80、40、20μg/mL的系列标准溶液。

1.2.3 6-姜酚肟标准溶液的配制 精确称取6-姜酚肟标准品0.064g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，配成640μg/mL的标准储备液。精确量取该储备液，倍比稀释成640、320、160、80、40、20μg/mL的系列标准溶液。

1.2.4 供试品溶液的配制 取某市售2.00g十三香粉，置于50mL容量瓶中，加入乙醇50mL并放入30℃恒温摇床2h，放冷后再定容，过滤待测。

1.3 HPLC测定条件

色谱柱：Diamonsil(TM)C18柱，250mm×4.6mm，5μm;流动相：A，水;B，乙睛;流速1mL/min;柱温：室温;检测波长280nm;进样体积20μL。

表1 HPLC梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 线性关系的考察

取1.2.1，1.2.2，1.2.3所配系列标准溶液进行HPLC测定，进样量均为20μL。每个浓度测定3次，峰面积取平均值。以标准溶液质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。胡椒碱的线性回归方程Y=4.143X×104-5913，(R2= 0.999，n=6);姜酚的线性回归方程Y=7.51X ×103+26016，(R2=0.999，n=6);姜酚肟的线性回归方程Y=9.68X×103+24592，(R2=0.999，n=6)。结果表明其相关程度高，能够反映胡椒碱、姜酚、姜酚肟浓度与各自峰面积的关系。胡椒碱在质量浓度5～160μg/mL，姜酚在质量浓度20～640μg/mL，姜酚肟在质量浓度20～640μg/mL时峰面积与浓度呈良好的线性关系。按一定比例混合三种标准溶液绘制标准对照图，见图1。

2.2 精密度实验

取胡椒碱、6-姜酚、6-姜酚肟标准溶液各一份，重复进样5次，测得峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.9%、0.6%和0.8%，该误差在仪器分析误差范围之内。

2.3 姜酚肟回收率的测定

图1 三种标准溶液标准对照图

在供试品中加入已知量的6-姜酚肟，进行回收率测定，测定结果如表2。结果表明：用6-姜酚肟做内标测定样品中6-姜酚及胡椒碱含量时，6-姜酚肟稳定，不与其他物质反应，符合内标的要求。

2.4 相对校正因子的测定

精确量取6-姜酚肟标准溶液，分别与胡椒碱、6-姜酚标准溶液混合;再按照倍比稀释逐级稀释5次，进样量20μL，重复以上步骤6次，峰面积取平均值，得到胡椒碱对6-姜酚肟的相对校正因子(fi/fs)及6-姜酚对6-姜酚肟的相对校正因子(fj/fs)，测定结果见表3。

该表数据显示，相对校正因子(fj/fs)与前人所得的6-姜酚对6-姜酚肟的相对校正因子相同;但因色谱柱，检测条件等不同，从而导致回归方程有所差异［18］。

2.5 样品测定

取1.2.4所配溶液8mL，加入2mL内标物6-姜酚肟(640μg/mL)，进行HPLC检测。其HPLC图见图2。重复三次，并分别进行内标法和外标法计算胡椒碱和6-姜酚的含量，其结果见表4。

图2 样品HPLC图

表4 内标法和外标法比较(mg·g-1)

表4结果经过F检验和t检验(置信度95%)，两种方法没有显著差异，不存在系统误差。

3 结论

通过回收率、精密度等指标检查以及与6-姜酚、胡椒碱外标法的比较，证实以6-姜酚肟为内标同时测定样品中的6-姜酚及胡椒碱是可行的。采用内标法测定这两种物质的含量，既不用重复作标准曲线，又可以避免由于胡椒碱和姜酚标样不稳定导致的误差，而且本实验的检测条件能同时测定产品中两种物质的含量;从而达到节省时间和试剂、降低检测成本和误差的目的。

表2 回收率实验结果

表3 相对校正因子

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Simultaneous determination of piperine and 6-gingerol in condiment by HPLC internal standard method

LIN Xian-zhe，GUO Mo-ting，WU Zhen-ju，LV Meng-sha，HUANG Xue-song*
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

The content of piperine and 6-gingerol in condiment were investigated by RP-HPLC with Diamonsil column(C18，5μm，250mm×4.6mm)at room temperature and 280nm.The mobile phase was water-methanol (gradient elution)with flow rate of 1mL/min.The 6-gingerol oxime was used as the internal standard.There was no distinct difference between the external standard method and internal standard method.The result showed that the linear range of piperine was 5～160μg/mL，while 6-gingerol and 6-gingerol oxime were 20～640μg/mL.The correlation coefficient were 0.9995，0.9997 and 0.9995，respectively.This condiment contained 20.23mg/g piperine and 4.33mg/g 6-gingerol.These results concluded that the method had no need to make standard curve duplicatly and can detect piperine and 6-gingerol simultaneously.

pipperjine;6-gingerol;6-gingerol oxime

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0452-03

十三香粉由胡椒、干姜、肉桂等十三种香料组成，治疗脾胃受寒、中阳不振、脘腹冷痛、寒泻冷痢、产后气血阻滞、少阴沉寒、浮热牙疼等症［1］。其中姜酚类物质(如6-姜酚)为干姜的主要有效成分，有抑制前列腺素合成、防腐杀菌、驱虫、护肤美容等多种功能［2-3］。胡椒碱为胡椒的主要辣味物质，有抗炎、治疗胃溃疡、降血脂、抗癌、镇痛、镇静、抗惊厥、杀虫等活性［4-5］。由于胡椒碱和姜酚都容易受酸、碱、热等因素影响而被破坏［6］;要同时测定十三香等混合香料中这两种物质的含量时，按照前人所用检测条件［7-9］，不足以使胡椒碱和6-姜酚出峰效果清晰。而Rai P D同步测定乌头碱、龙葵碱、胡椒碱［10］及Verma同步检测姜黄素、胡椒碱和麝香草酚［11］时，均使用在不同时间段变波长的方法达到检测目的。然而该方法波峰虽然明显，但波峰之前分离不开，会相互影响。本实验研究利用姜酚肟做内标［12-13］，根据有关研究［14-15］的检测条件加以改良，以便同时测定十三香中胡椒碱和姜酚含量。

2010-12-13 *通讯联系人

林先哲(1985-)，男，硕士研究生，研究方向:功能食品。

广东省高校科技成果产业化项目(cgzhzd0806);农业部公益项目(200903018)。