基于二氧化钛/碳纳米管/壳聚糖纳米复合薄膜制备葡萄糖生物传感器

李俊华 邝代治 冯泳兰 刘梦琴 邓华阳

(1衡阳师范学院化学与材料科学系，功能金属有机材料湖南省高校重点实验室，衡阳 421008)

(2湘潭大学化学学院，湘潭 411105)

基于二氧化钛/碳纳米管/壳聚糖纳米复合薄膜制备葡萄糖生物传感器

李俊华＊,1邝代治1冯泳兰1刘梦琴1邓华阳2

(1衡阳师范学院化学与材料科学系，功能金属有机材料湖南省高校重点实验室，衡阳 421008)

(2湘潭大学化学学院，湘潭 411105)

利用壳聚糖(CHI)溶液分散了纳米二氧化钛(nano-TiO2)和多壁碳纳米管(MWCNT)，将该分散液修饰于玻碳电极表面形成纳米复合薄膜；用戊二醛为交联剂在该纳米复合层上固定了葡萄糖氧化酶(GOx)，同时以二茂铁为电子媒介体构建了一种新型葡萄糖传感器。利用扫描电镜(SEM)、交流阻抗(AC)对所制备的传感器进行了表征，同时用循环伏安法(CV)和计时电流法(CA)考察了其对葡萄糖的电催化氧化性能。实验结果表明，在优化测试条件下该传感器对葡萄糖在0.5～20.0 mmol·L-1范围内有线性响应，检出限为0.2 mmol·L-1；电流达到95%的稳态时间小于5 s；此生物传感器具有良好的重现性和选择性，能有效排除抗坏血酸、尿酸等常见干扰物的影响并成功应用于饮料中葡萄糖含量的测定。

纳米二氧化钛；碳纳米管；葡萄糖氧化酶；生物传感器

0 引 言

葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，它氧化反应放出的热量是人类生命活动所需能量的重要来源。葡萄糖以游离的形式存在于植物的浆汁中，尤其以水果和蜂蜜中的含量为多，其定量测定在食品质量控制中占有很重要的位置。同时糖尿病是世界范围的一个公共健康问题，葡萄糖的临床分析要求也日益提高。迄今为止，测定葡萄糖的方法主要包括动力学分光光度法[1]、激光拉曼光谱内标法[2]、酶荧光毛细分析法[3]、酶催化荧光反应法[4-5]及生物传感器测定法[6-7]等。自1967年Updike等[7]研制出第一支葡萄糖氧化酶生物传感器以来，由于其操作简单、制作成本低、易微型化以及灵敏度高、响应时间短、选择性和稳定性良好等优点而被各国科学家广泛研制。虽然无酶传感器具有不受酶活性变化影响的优点，但基于葡萄糖氧化酶的安培型电化学传感器是研究最多的一类；从检测生成双氧水的第一代葡萄糖传感器，依靠媒介体传递电子的第二代葡萄糖传感器，到利用酶和电极间直接电子传递的第三代传感器。酶的有效固定是酶生物传感器制备的关键，它将直接影响到传感器的灵敏度和稳定性。目前报道关于酶的固定方法主要有交联法[8]、吸附法[9]、包埋法[10]等；固定酶的主要载体有金溶胶[9]、硅溶胶[10]以及各种纳米复合材料[11-18]。为了得到实际应用更广泛的葡萄糖传感器，新的酶固定方法和材料不断被研究，以满足在更复杂环境中葡萄糖的测定要求。制备酶生物传感器另一个关键的步骤是如何降低酶基质与电子媒介体之间的扩散阻碍；本文拟采用具有三维多孔结构的纳米复合薄膜来提高酶的固定量及电子的传递速率。

纳米材料具有表面效应、体积效应和介电限域效应等不同于块体材料和原子或分子的介观性质，加之具有导电性和完整的表面结构，可作为优良的电极材料。同时纳米颗粒尺寸很小，表面的键态和电子态与内部不同，导致其表面活性位点增加，用作催化剂时具有很高的活性和选择性。纳米构界本身还可以改善酶电极的性能，如碳纳米管(CNTs)[12-14]、金纳米粒子[15-16]、普鲁士蓝纳米粒子[17]以及Fe3O4纳米粒子[18]等不仅增加了酶的负载量和稳定性，并且可提高酶的催化活性，从而显著提高酶电极的检测灵敏度。CNTs是1991年发现的一种新型碳材料[19]，由于其具有奇特的电学性能、明显的量子效应、大的比表面积、高的稳定性及强的吸附性能而被广泛研究。利用CNTs对电极表面进行修饰时，除了可将材料本身的物化特性引入电极界面外，同时还拥有纳米材料的大比表面积和粒子表面带有较多功能基团等特性，从而对某些物质的电化学行为产生特有的催化效应[20]。另外，CNTs的引入还可降低底物的过电位，促进电子传递、增大电流响应，提高电化学反应的速率以及电极的选择性和灵敏度，可以测定多种具有电活性和非电活性的样品[21-22]。纳米二氧化钛(nano-TiO2)是目前研究较为活跃的无机纳米材料之一[23]，其不仅具有颗粒小、比表面积大、光吸收性好、表面活性大、催化效率高和分散性能好等优点[24-25]，同时还兼具良好的生物兼容性和优异的化学稳定性而被广泛用于构建生物传感器[26-27]和制备新能源材料[28-29]。目前 nano-TiO2已成功地用于固载酶、DNA等生物活性物质，其可提高酶的吸附量和稳定性以及增强酶的生物活性[26-27]。壳聚糖(CHI)是甲壳素脱乙酰化的产物，是一种无毒的天然高分子化合物，具有优良的生物兼容性，有利于保持酶的生物活性，而且CHI在作固定活性酶载体的同时还能抑制一些生物小分子的电化学反应，可用来研制抗干扰性好的生物传感器[6]。

本文以nano-TiO2和多壁碳纳米管(MWCNT)为主要载体，将其分散到CHI溶液中形成纳米复合薄膜；应用交联法将葡萄糖氧化酶(GOx)固定于纳米复合膜上，并结合电子媒介体制得一种新型葡萄糖生物传感器。利用扫描电镜(SEM)和交流阻抗(AC)对所制备的传感器进行了表征，同时考察了葡萄糖在传感器上的电化学行为和优化测定条件。实验结果表明，该传感器具有灵敏度高、抗干扰性强以及使用寿命长等优越性能，从而具备潜在的实用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站 (上海辰华仪器公司)；JSM-6700F型场发射扫描电镜(日本JEOL公司)；超声波清洗机 (宁波海曙科生超声设备公司)；pHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)；DF-101Z型恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸公司)。

MWCNT(纯度大于95%，深圳纳米港公司)；nano-TiO2(纯度大于 99%，德国 Digussa公司)；GOx(EC 1.1.3.4，200 U·mg-1，Sigma 公司)；葡萄糖 (国药集团上海化学试剂公司)；戊二醛(25%，国药集团上海化学试剂公司)；CHI(脱乙酰度 75%～85%，Sigma公司)；Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(PBS)；二茂铁 (纯度＞98%，湖南湘中化学试剂有限公司；溶于乙醇后分散在PBS中使用，后文描述的二茂铁浓度均指其分散在测试底液中形成的最终浓度)；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 传感器的制备

将玻碳电极(GCE，Φ=3 mm)依次用 0.3 和 0.05 μm的Al2O3粉抛光使成镜面，然后依次用无水乙醇、1∶1硝酸和蒸馏水超声清洗待用。将MWCNT于20%HNO3中浸泡14 h，过滤洗至中性，晾干至恒重，得纯化的MWCNT；然后将纯化的MWCNT管于混 酸(VHNO3∶VH2SO4=1∶3)中超声 5 h，水洗至中性，抽滤，120℃烘干即得羧基化MWCNT。取处理过的MWCNT和nano-TiO2各2 mg同时加入到20 mL 0.2%CHI溶液中，超声分散30 min，取此悬浊液5 μL均匀滴加在处理好的GCE表面上，用红外灯烘干即得到TiO2/MWCNT/CHI/GCE。然后，以0.25%的戊二醛为交联剂，取其1 μL滴加在修饰电极表面于室温晾干后滴涂 2 μL GOx溶液 (1wt%，pH 6.8 PBS)于4℃冰箱中存放12 h以上备用。为了进行比较，分别将MWCNT和 nano-TiO2单独分散在CHI溶液中，按上述方法制成MWCNT/CHI/GCE和TiO2/CHI/GCE。

1.3 电化学测试方法

采用三电极实验装置：修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。在室温下，以 2.5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]混合0.1 mol·L-1KCl为底液，采用循环伏安法(CV)和 AC法对电极的修饰过程进行表征。此外，以pH 6.8的PBS为测试底液，在不同实验条件下利用CV法和计时电流法(CA)考察葡萄糖测试的优化条件和线性响应。

2 结果与讨论

2.1 传感器的电镜表征

从图1a可见，放大1.5万倍的TiO2/MWCNT/CHI薄膜像花簇一样展开，MWCNT和CHI类似花杆和花茎，TiO2类似花蕊，它们在整体上呈现出三维网状结构；同时有许多孔隙存在，这种多孔网状的结构非常适合生物酶的固定。从图1b观察到放大10万倍后的薄膜，MWCNT呈线条状，TiO2呈管点状，两者都未出现团聚现象，静止放置一段时间后也未出现团聚现象，说明CHI溶液能将它们很好的分散；且纳米材料直径都在20～60 nm范围内，能很好的形成纳米复合膜。

2.2 传感器的电化学表征

图2表示在偏置电位为0.0 V时,电压振幅为5 mV,频率为 0.1～105Hz 时以 2.5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为探针，不同电极在 0.1 mol·L-1KCl底液中的交流阻抗谱图谱。从图中可见，探针离子在裸GCE(a)和TiO2/CHI/GCE(b)上由于其半圆型阻抗非常小而未明显形成，却出现了一近似直线；说明此时电子很容易到达电极表面，电化学阻抗较小，电极过程主要受到扩散控制。探针离子在MWCNT/CHI/GCE(c)和TiO2/MWCNT/CHI/GCE(d)上于高频区出现一半圆，对应电化学极化；随后低频区出现一直线，对应于浓差极化；且探针离子在TiO2/MWCNT/CHI/GCE上的电化学阻抗值 (Rct，约145 Ω)小于其在 MWCNT/CHI/GCE上的 Rct(约 190 Ω)，说明纳米膜中随TiO2的加入有利于电极表面与活性物质之间形成电子通道，从而提高了电子在复合薄膜修饰传感器上的转移速率；而MWCNT的加入有利于薄膜形成多孔网状结构利于更多的活性物质进行富集。探针离子在GOx/TiO2/MWCNT/CHI/GCE上的Rct(约165 Ω)稍大于其在TiO2/MWCNT/CHI/GCE上的Rct，说明GOx成功地固定在纳米复合膜上。

图 3 表示在扫速为 50 mV·s-1时，以 2.5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为探针，不同电极在 0.1 mol·L-1KCl底液中的循环伏安图。从图中可见，探针离子在裸GCE(a)和TiO2/CHI/GCE(b)上的氧化还原峰电流最大，说明其电化学阻抗较小，利于电子的转移。探针离子在TiO2/MWCNT/CHI/GCE(d)上的氧化还原峰电流大于其在 MWCNT/CHI/GCE(c)上的氧化还原峰电流；进一步说明了TiO2的加入易于形成电子转移通道，利于活性物质发生氧化还原反应。同时在TiO2/MWCNT/CHI/GCE上的氧化与还原峰电流大小相近，峰电位相差较小(约 62 mV)；且当扫速在10～300 mV·s-1变化时，氧化峰电流与扫速的平方根成正比，说明探针离子在该传感器上的电化学反应是一个可逆过程。对于可逆过程，在不同扫速下根据[30]Ipa=2.69×105n3/2AC0DR1/2v1/2可以计算修饰电极的表观面积(其中Ipa表示氧化峰电流，C0表示溶液本体浓度，n表示电子转移数，A表示表观面积，v 表示扫速)。 对于 K3[Fe(CN)6]，n=1，DR=5.9×10-5cm·s-1，通过计算可知TiO2/MWCNT/CHI/GCE的表观面积为 0.183 5 cm2， 相比 TiO2/CHI/GCE(0.1192 cm2)和 MWCNT/CHI/GCE(0.134 0 cm2)的表观面积分别增加近54%和37%，说明由两种纳米材料同时分散在CHI中形成的复合薄膜具有最大的表观面积，利于更多的生物酶在该表面上进行固定。另外，探针离子在GOx/TiO2/MWCNT/CHI/GCE(e)上氧化还原峰电流稍小于其在TiO2/MWCNT/CHI/GCE(d)上的氧化还原峰电流，进一步说明了GOx成功地固定在纳米复合膜上。

2.3 传感器的电化学性能

图4表示了GOx/MWCNT/CHI/GCE在不同电解液中的循环伏安图。从图可见该酶电极在pH为6.8的PBS底液中背景电流较小，而其在含0.2 mmol·L-1二茂铁的底液中出现峰型较好的氧化还原峰，这对应于二茂铁的氧化还原反应。同时进一步实验证明，当扫速在10～300 mV·s-1之间变化时，峰电位基本不变；且峰电流与扫速的平方根成正比，说明该电化学过程是一典型的扩散控制过程。当葡萄糖加入含 0.2 mmol·L-1二茂铁的PBS底液中时，二茂铁的氧化峰电流增加，还原峰电流急剧减小至不明显；同时随着葡萄糖浓度的增加，二茂铁的氧化峰电流也增加，表明该过程是一个典型的电催化过程。图4插图表示了3种电极在含0.2 mmol·L-1二茂铁的PBS底液中的循环伏安曲线。从图中可见，二茂铁在GCE、TiO2/MWCNT/CHI/GCE和GOx/TiO2/MWCNT/CHI/GCE上的氧化还原峰电流有依次减小趋势，说明纳米复合薄膜能稳定地修饰在电极表面，而复合薄膜和GOx的存在对二茂铁的扩散有一定的阻碍作用；但扩散阻碍并不会降低传感器的响应和灵敏度[31-32]，也说明了GOx/TiO2/MWCNT/CHI对于电子媒介体二茂铁是一传质阻碍较小的纳米膜。同时3种电极的氧化还原电位均出现在300 mV和240 mV左右，所以二茂铁可以在电极表面无阻碍地与电化学活性位点交换电子。

图5为4种酶电极在0.2 mmol·L-1二茂铁混合16 mmol·L-1葡萄糖的 PBS(pH 6.8)底液中产生的循环伏安图。从图中可见GOx/GCE(a)、GOx/TiO2/CHI/GCE(b)和GOx/MWCNT/CHI/GCE(c)对葡萄糖的响应较小，GOx/TiO2/MWCNT/CHI/GCE(d)对葡萄糖电催化响应最为灵敏，其氧化峰电流最大，峰电位约为0.3 V。从上述比较可知，由于多孔的三维网状结构和大的表观面积，GOx已牢固地固定在 TiO2/MWCNT/CHI薄膜上，利于葡萄糖的氧化反应发生。同时也说明电子媒介体二茂铁能够在电极表面与固定在纳米复合膜中的GOx的氧化还原中心之间可以进行有效地电子传输，使得该传感器对葡萄糖表现出良好的电催化氧化作用。GOx依赖的催化反应机理可以用下列式子表示：

式中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)分别代表二茂铁的还原态与氧化态形式，GOx(FAD)和GOx(FADH2)分别代表葡萄糖氧化酶的氧化态和还原态。

2.4 传感器响应的优化条件

2.4.1 酶的固定量影响

酶反应速率很大程度上决定于酶的活性，酶的固定量将直接影响生物传感器的灵敏度。在TiO2/MWCNT/CHI薄膜上分别滴加2 μL含不同酶量的酶溶液(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg·mL-1)制得一系列葡萄糖传感器，考察固定化酶量对传感器响应性能的影响。结果表明，传感器电流响应值随着酶含量的增加而急剧增大，而当酶用量大于5.0 mg·mL-1时，其响应增大值趋于平缓。因此，本实验选用含量为5.0 mg·mL-1的葡萄糖氧化酶来修饰电极。

2.4.2 电子媒介体浓度的影响

在pH值为6.8的PBS底液中，分别加入乙醇配制的不同浓度二茂铁(0.05～0.5 mmol·L-1)，考察其对葡萄糖传感器电流响应值的影响。随着二茂铁浓度的增加，葡萄糖氧化峰电流有微幅的增大。但当二茂铁浓度大于0.2 mmol·L-1时，传感器的响应电流无多大变化，同时考虑到二茂铁的溶解性所以实验选用电子媒介体的浓度为 0.2 mmol·L-1。

2.4.3 工作电位的影响

用CA法考察了工作电位对葡萄糖传感器电流响应值的影响。在混合0.2 mmol·L-1二茂铁和16 mmol·L-1葡萄糖的 PBS(pH 6.8)底液中，于不同工作电位(0.0～0.5 V)下测定其稳态电流。 当电位从 0.0 V增大至0.3 V过程中，响应电流逐渐升高，在0.3 V时达到最大值；而大于0.3 V后，电流增幅不大趋于稳定。因此，本实验选用0.3 V的工作电位为宜。

2.4.4 pH 值的影响

在同时含有 0.2 mmol·L-1二茂铁和 16 mmol·L-1葡萄糖的 PBS底液中，考察缓冲液pH值在5.0～9.0范围内对本传感器响应的影响。 pH 值在6.0～8.0之间时，葡萄糖氧化峰电流值较大且较为稳定；当 pH＜6.0 或 pH＞8.0 时，电流响应值明显降低。过酸或过碱的底液会破坏酶的结构而使之活性降低，从而导致传感器灵敏度下降；故本实验选用pH值为6.8的PBS底液。

2.4.5 测试温度的影响

控制测试温度分别为 10、20、30、40 和 50 ℃，考察实验温度对该葡萄糖传感器的影响。随着温度的升高，葡萄糖氧化峰电流值呈现出先增大后减小的趋势。考虑到在高温条件下酶容易失活，所以本实验控制温度为30℃。

2.5 线性范围、检出限和米氏常数

在上述优化实验条件下，基于TiO2/MWCNT/CHI纳米复合膜制备的生物传感器对葡萄糖催化氧化的电流响应值与其浓度在 0.5～20.0 mmol·L-1之间呈现良好的线性关系，线性回归方程为I(mA)=0.009 84C(mmol·L-1)+0.029 27(r=0.998 1)；电流达到95%的稳态时间小于5 s。以3倍空白的标准偏差除以标准工作曲线的斜率计算出传感器的检出限为0.2 mmol·L-1；以标准工作曲线的斜率值比上该工作电极表观面积得到传感器灵敏度为 53.62 μA·cm-2·(mmol·L-1)-1；本法得到的灵敏度高于分别使用Fe3O4/CHI/Nafion[11.54 μA·cm-2·(mmol·L-1)-1][18]和AuNP/MWCNT[7.3 μA·cm-2·(mmol·L-1)-1][15]纳米复合膜所制备的生物传感器灵敏度。米氏常数Km(Michaelis-Menten Conxtent)是酶催化反应的特征动力学参数，该参数能表征酶与底物之间亲和力的大小。Km可由Lineweaver-Burk方程[33]1/Iss=1/Imax+Km/(CImax)求得；式中Iss为加入一定浓度底物后测得的稳态电流，C为Iss对应的底物浓度，Imax为加入底物达饱和后测得的最大电流值。通过1/Iss与1/C作图求得Lineweaver-Burk方程的斜率和截距，从而求得米氏常数为 6.18 mmol·L-1。 相比用 TiO2溶胶-凝胶固定 GOx(8.04 mmol·L-1)[34]以及壳聚糖和碳纳米管固定 GOx(19.30 mmol·L-1)[35]得到的米氏常数，本法得到米氏常数较低，表明该传感器对葡萄糖有较强的亲和能力。

2.6 葡萄糖传感器的重现性、寿命和抗干扰性

每间隔10 h用同一传感器对16 mmol·L-1葡萄糖溶液进行测定，重复10次所得相对标准偏差(RSD)为3.2%。用相同纳米复合膜制得10个葡萄糖传感器，对 16 mmol·L-1葡萄糖溶液进行测定，RSD为4.8%。将所制备的传感器存放于4℃冰箱中，两周后信号响应值为初始值95.4%；2个月后信号响应值为初始值的84.2%。实验结果表明，所制得的TiO2/MWCNT/CHI纳米复合薄膜能将GOx牢固地固定在电极表面，并能保持长时间的生物活性。

在实际样品测定时，一些葡萄糖共存物可能会对测定产生影响。本实验考察了30倍的抗坏血酸、尿酸、半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸、酪氨酸等多种干扰物质对葡萄糖测定的影响。实验结果表明，这些物质对葡萄糖的测定几乎不产生干扰，说明本文制得的生物传感器具有较好的选择性和较强的抗干扰能力。

2.7 实际样品的测定

分别取某品牌4种不同水果汁饮料，用含 0.2 mmol·L-1二茂铁的 PBS(pH 6.8)溶液稀释 100 倍后测定其葡萄糖含量。在本文确定的最佳实验条件下，采用CA法测定了上述4个样品中葡萄糖的含量(每个样品测定5次取平均值)。同时进行了加标回收率试验，回收率在 98.0%～106.0%之间(测定结果见表1)，所得结果令人满意。

表1 饮料样品中葡萄糖含量的测定结果Table 1 Glucose content determination results of beverage samples

3 结 论

本文以纳米二氧化钛、多壁碳纳米管和壳聚糖复合薄膜为载体，利用戊二醛为交联剂和二茂铁为电子媒介体制备出一种新型的葡萄糖生物传感器；该传感器将纳米颗粒和有机功能材料的优点有机地结合起来。采用纳米膜构成的复合固酶基质，增强了GOx活性中心与电子媒介体之间电子的传递速率；以交联法固定GOx于纳米膜表面，解决了其易溶于水的问题；同时该传感器具有灵敏度高、使用寿命长和抗干扰性强等优点；另外其制作过程简单，成本较低，可重复使用，具有潜在的商用价值。

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Preparation of Glucose Biosensor Based on the Nanocomposite Film of Titanium Dioxide/Carbon Nanotubes/Chitosan

LI Jun-Hua＊,1KUANG Dai-Zhi1FENG Yong-Lan1LIU Meng-Qin1DENG Hua-Yang2

(1Key Laboratory of Functional Organometallic Materials of Hunan Province College,Department of Chemistry and Material Science,Hengyang Normal University,Hengyang,Hunan 421008,China)
(2College of Chemistry,Xiangtan University,Xiangtan,Hunan 411105,China)

A nanocomposite film was prepared by dispersing titanium dioxide nanoparticles (nano-TiO2)and multi-wall carbon nanotubes(MWCNT)into chitosan(CHI)solution.The glucose oxidase(GOx)was immobilized on this nanocomposite film through cross-linking reactions with glutaraldehyde,and a new glucose sensor was constructed using ferrocene as an electron transfer medium.The prepared sensor was characterized by scanning electron microscope (SEM)and alternating current impedance (AC),and its electrocatalytic performances for glucose were also investigated by cyclic voltammetry(CV)and chronoamperometry(CA).The experimental results showed that the sensor exhibited linear response for glucose in the range of 0.5 ～20.0 mmol·L-1under the optimized testing condition,and the detection limit was 0.2 mmol·L-1.The current achieved its 95%steady state value within 5 s.This biosensor,which had favorable reproducibility and selectivity,can obviate the influence of the common interferent such as ascorbic acid and uric acid.This sensor was successfully applied to determine the content of glucose in beverage.

nano-TiO2;carbon nanotubes;glucose oxidase;biosensor

O657.1

A

1001-4861(2011)11-2172-07

2010-12-13。收修改稿日期：2011-07-21。

湖南省教育厅创新平台开放基金(No.09K099，No.10K010)，衡阳市科技局(No.2009KG50)和衡阳师范学院青年骨干教师基金(2010)资助项目。

＊通讯联系人。 E-mail：junhua325@yahoo.com.cn