镝氨基酸(Tyr,Trp)咪唑配合物的合成与抗菌性能研究

刘杰凤 韩寒冰 周天

摘要：为了开发高生物活性的稀土氨基酸配合物抑菌剂，在酸性乙醇介质中，合成了稀土镝（Ｄｙ３＋）氨基酸（Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）咪唑三元配合物，由其一般性质、荧光性能及紫外吸收光谱得到初步确认。以Ｄｙ３＋、咪唑及镝氨基酸二元配合物为对照，研究了镝氨基酸咪唑三元配合物的抑菌性能。结果表明，镝氨基酸二元及镝氨基酸咪唑三元配合物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，咪唑参与配位后，更加强了配合物的抗菌性能，当两类配合物浓度≥８ ｇ／Ｌ时，对两种供试菌均有较强的抑制作用；镝酪氨酸配合物抑菌作用较镝色氨酸配合物强，其最低抑菌浓度可低至２～４ ｇ／Ｌ。

关键词：镝；稀土配合物；酪氨酸；色氨酸；咪唑

中图分类号：Ｏ６２１．３＋９１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）16－3310-03

Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｄｙ３＋ ｗｉｔｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）

ａｎｄ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ

ＬＩＵ Ｊｉｅ－ｆｅｎｇ，ＨＡＮ Ｈａｎ－ｂｉｎｇ，ＺＨＯＵ Ｔｉａｎ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｏｍｉｎｇ ５２５０００， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｄｙ３＋- ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ （Ｔｙｒ，Ｔｒｐ） ａｎｄ Ｄｙ３＋-ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ （Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）-ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒａ， ｐｈｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ showed that ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｈａd ｖａｒｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ； ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ waｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｂｉｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ. Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｅｘｃｅｅｄed ８ ｇ／Ｌ， ｉｔ ｃould ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｒｅｓｔｒａｉｎ the ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｙｒ－ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ had better ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｔｉｃ activity the Trp-complexes，ｔｈｅ minimum inhibitory ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ could be in the ｒａｎｇe ｏｆ ２~４ ｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｙｓｐｒｏｓｉｕｍ； ｒａｒｅ ｅａｒｔｈ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ； Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ； Ｌ－ｔｒｙｐｌｏｐｈａｎ； ｉｍｉｄａｚｏｌｅ

稀土氨基酸配合物是以稀土金属离子为中心，以氨基酸的羧基为配位基团形成的一种配合物。自２０世纪末稀土氨基酸配合物獨特的生物活性被发现以来［１，２］，稀土氨基酸配合物的研究一直都是生物无机化学领域的热门研究内容。研究者发现，多数稀土氨基酸配合物均具有杀菌、消炎、抗凝血和降血糖、抗癌等生理作用［３－７］。当选择具有抑菌性能的配体与具有较好生理生化性能的稀土络合，能发生协同作用使其抗菌活性得到提高。氨基酸是生物体内蛋白质组成的基本单位，当稀土离子与氨基酸形成配合物用作抑菌剂时，具有杀菌能力强，抑菌谱广，溶液酸性接近生理ｐＨ值等优点，并且能避免直接利用稀土氧化物或稀土离子对生物体或细胞的氧化损害作用。尽管人们已对稀土氨基酸配合物开展了广泛的研究，但此类配合物的实际应用还受诸多限制，且目前对稀土氨基酸的三元或多元配合物的研究还不多，所以研究开发具有较强生理功能的稀土氨基酸三元配合物具有实际意义。在前期工作的基础上［８］，以酪氨酸或色氨酸为第一配体、咪唑为第二配体，合成了镝氨基酸二元配合物和镝氨基酸咪唑三元配合物，并对其抑菌性能进行了研究。

１材料与方法

１．１主要试剂和仪器

氧化镝（Ｄｙ２Ｏ３），高纯试剂；酪氨酸（Ｔｙｒ），色氨酸（Ｔｒｐ），咪唑（Ｉｍ），生化试剂；牛肉膏蛋白胨培养基；金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ），大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），广东省微生物研究所提供。

ＵＶ－３０００紫外透射分析仪，珠海黑马医学仪器有限公司；ＴＵ－１８１０紫外可见分光光度计，北京普通分析仪器厂；ＬＳＳ型荧光光谱仪，美国ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司。

１．２配合物的合成

１．２．１镝氨基酸二元配合物的合成使镝氧化物与适当过量的盐酸反应生成氯化镝盐，然后按

ｎ（ＤｙＣｌ３·６Ｈ２Ｏ）∶ｎ（ＡＡ＝Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）＝１∶３配比投料。先准确称取一定量的ＤｙＣｌ３·６Ｈ２Ｏ和氨基酸，分别溶于９５％乙醇溶液中，氨基酸溶解时需用１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ将溶液调至ｐＨ值为３左右，然后将氯化稀土盐与氨基酸溶液混合，６０～６５ ℃下加热搅拌回流，反应约３．０～４．０ ｈ后，转移至水浴中缓慢蒸发浓缩、真空干燥后，得白色固体配合物。

１．２．２镝氨基酸咪唑三元配合物的合成按ｎ（ＤｙＣｌ３·６Ｈ２Ｏ）∶ｎ（ＡＡ＝Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）∶ｎ（Ｉｍ）＝１∶３∶１配比投料。先准确称取一定量的ＤｙＣｌ３·６Ｈ２Ｏ和氨基酸，按上述方法溶解，将两溶液混合。６０ ℃左右水浴搅拌回流１．５ ｈ后，加入咪唑乙醇溶液，继续搅拌回流，反应约５．０ ｈ，转移至水浴中缓慢蒸发浓缩、真空干燥后，得白色固体配合物。

１．３稀土配合物的抑菌试验

１．３．１抗菌性试验分别将配体、氯化镝盐及其二元和三元配合物配成浓度为２０ ｇ／Ｌ的溶液，灭菌后，各取２ ｍＬ与３０ ｍＬ已灭菌的培养基混合，倒平板，涂布法分别接种０．１ ｍＬ稀释倍数为１０５的供试菌悬液，以不添加镝化合物的培养基作对照，观察３７℃下菌落生长情况，并由培养４８．０ ｈ的菌落数（ＣＦＵ）计算抑菌率（ＩＲ，％）：

ＩＲ＝［（对照生长菌落数－含药品的生长菌落数）／对照生长菌落数］×１００％

１．３．２最低抑菌浓度（ＭＩＣ）测定将浓度为１６ ｇ／Ｌ的稀土配合物溶液进行倍比稀释成８、５、２、１ ｇ／Ｌ ５个浓度梯度，各取２ ｍＬ与３０ ｍＬ培养基混合，涂布法接种０．１ ｍＬ稀释倍数为１０５的供试菌悬液，３７ ℃培养４８．０ ｈ，以“不长菌”的最低稀释浓度定为最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。

１．３．３抑菌圈大小的测定分别配制最低抑菌浓度的稀土配合物溶液，无菌操作下，将直径为１３．０ ｍｍ滤纸片浸入上述溶液中１０ ｍｉｎ。涂布法接种０．１ ｍＬ稀释倍数为１０５的供试菌悬液，待平板上菌液稍干后，取药物滤纸片放置于平板中央。３７ ℃培养２４．０ ｈ后测量抑菌圈直径。

２结果与分析

２．１镝配合物的物理性质及荧光性能

镝稀土盐及其配合物均是白色粉末状，但配合物溶解性能明显区别于稀土盐，稀土盐易溶于水，可溶于无水乙醇；而配合物微溶于无水乙醇及微溶于水，易溶于二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）。

稀土盐及其配合物在紫外透射分析仪下检测发现，其均发出镝相应离子Ｄｙ３＋的特征荧光黄绿荧光，但镝氨基酸咪唑三元配合物发射的荧光明显减弱。镝酪氨酸二元及镝酪基酸咪唑三元配合物的荧光光谱图见图１。由图１可见，Ｄｙ３＋及其配合物均可以观察到波长为４８４ ｎｍ、５７７ ｎｍ荧光谱线，它们分别是Ｄｙ３＋的 ４Ｆ９／２→６Ｈ１３／２、４Ｆ９／２→６Ｆ１５／２跃迁。Ｄｙ３＋-Tyr二元配合物荧光明显比相应的盐强，这是因为离子和配体的能量匹配程度好，配体能量向中心离子传递的缘故。但Ｄｙ３＋-Tyr-Im三元配合物荧光较弱，这除了稀土离子的发光特性敏锐地受到周围环境的影响有关外，还与配合物中心离子Ｄｙ３＋含量大辐度降低有关。

根据镝化合物的一般性质及荧光特性，参照已有的工作基础［８］，初步认为镝离子已与配体键合。

２．2镝配合物的紫外吸收光谱

以二甲基亚砜为溶剂，浓度为5 mL/L左右，在紫外可见分光光度计下扫描了镝氯化物、酪氨酸、色氨酸、咪唑及相应配合物的吸收光谱（２００～８００ ｎｍ），其最大吸收峰的特征波长列于表１。吸收光谱表明，以上化合物在紫外光区均有最大吸收，但在可见光区几乎无光吸收。Ｄｙ３＋-Tyr，Trp二元与Ｄｙ３＋-Tyr，Trp-Im三元配合物的最大吸收波长λｍａｘ与咪唑及相应氨基酸相比均有不同程度的改变，表明镝稀土盐与配体均有成键作用，而合成产物吸收峰值相近且与其对应盐酸盐不同，说明形成了结构相似的新配合物［３，８］。

２．3镝配合物的抑菌性能

２．3．１镝配合物的抑菌性能判断氯化镝盐及相应的配合物、咪唑的抑菌试验结果见表２。表２表明，在浓度为２０ ｇ／Ｌ时，稀土镝化合物及其配合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落抑制率均达到１００％。而咪唑对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落抑制率分别为８７.0％和５３．２％，说明氯化镝盐及其配合物的抑菌能力比咪唑强。

２．3．２镝配合物的最低抑菌浓度根据抑菌试验结果，将用药浓度配成质量浓度为１６ ｇ／Ｌ的溶液，倍比稀释成５个浓度梯度进行试验，以确定最低抑菌浓度，结果见表３。表３结果表明，镝酪氨酸咪唑三元配合物的最低抑菌浓度低至２ ｇ／Ｌ；同一种配合物，对不同的微生物的抑制作用也不同，镝氨基酸配合物对大肠杆菌的抑制作用比作用于金黄色葡萄球菌强。当镝氨基酸配合物的浓度≥８ ｇ／Ｌ时，均对两种供試菌的生长产生较强的抑制作用。稀土配合物的抑菌活性随稀土配合物的浓度增加而增强，而咪唑参与配位后，又增强了稀土配合物的抑菌作用。

２．3．３镝配合物的抗菌性能比较为了进一步了解配合物的抗菌性能，研究以抑菌圈大小为依据比较了镝配合物的抗菌能力。以抑菌圈直径对培养时间作图，结果见图２及图３。由图２、图３结合最低抑菌浓度试验结果可知，试验菌在培养３６．０～７２．０ ｈ内对镝配合物的敏感性最大；大肠杆菌对镝配合物的敏感程度比金黄色葡萄球菌高；配体不同，抑菌作用有较大的差异，酪氨酸配合物较色氨酸配合物强；镝氨基酸咪唑三元配合物普遍较镝氨基酸二元配合物的抑菌能力更强、更持久，显示镝氨基酸咪唑三元配合物在杀菌、消炎等应用方面具有很大的潜在应用价值。

３结论

合成了镝氨基酸（Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）二元及镝氨基酸（Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）咪唑三元配合物，并由其溶解性能、荧光性能及紫外吸收光谱得到初步确认。通过抑菌活性试验发现：

１）镝配合物具有较好的抗菌功效，其抑菌活性比氯化镝盐及配体咪唑强，镝氨基酸咪唑三元配合物的抑菌活性优于镝氨基酸二元配合物。

２）镝配合物浓度≥８ ｇ／Ｌ时，对两种供试菌均有较强的抑制作用。

３）不同氨基酸配体，抗菌性能有一定差异，酪氨酸配合物优于色氨酸配合物，其最低抑菌浓度可低至２～４ ｇ／Ｌ范围。

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