氯通道在华蟾酥毒基诱导的鼻咽癌细胞凋亡中起重要作用*

柏志全, 李春英, 李 媛, 马文波, 朱林燕, 叶文才, 张冬梅, 王立伟△, 陈丽新△

(暨南大学 1医学院生理系，2医学院药理系，3药学院中药及天然药物研究所，广东 广州 510632)

·论著·

氯通道在华蟾酥毒基诱导的鼻咽癌细胞凋亡中起重要作用*

柏志全1 ▲, 李春英1 ▲, 李 媛2, 马文波1, 朱林燕2, 叶文才3, 张冬梅3, 王立伟1△, 陈丽新2△

(暨南大学1医学院生理系，2医学院药理系，3药学院中药及天然药物研究所，广东 广州 510632)

目的： 研究氯离子通道在华蟾酥毒基(CBG)诱导低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡和凋亡性容积减小中的作用。方法实验设立空白对照组、CBG高、中、低剂量组及CBG与氯通道阻断剂NPPB 联合作用组。Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡率，活细胞图像分析法检测细胞容积变化，全细胞膜片钳法记录氯电流。结果(1)CBG浓度依赖性诱导鼻咽癌细胞凋亡，高剂量CBG(8 μmol/L)诱导的细胞凋亡率为43.2％；(2)CBG可诱导细胞产生凋亡性容积减小，在CBG作用早期(50 min),细胞容积减小约9.9％。(3)CBG可激活氯通道，产生一个无明显外向优势的氯电流。(4)氯通道阻断剂NPPB可抑制CBG诱导的细胞凋亡、凋亡性细胞容积减小和氯电流。NPPB对CBG诱导的细胞凋亡和凋亡性容积减小的抑制率分别达80.1％和74.8％。结论以上结果提示CBG可能通过激活氯通道而诱导细胞凋亡，氯通道的激活可能在CBG抗肿瘤机制中起重要作用。

华蟾酥毒基； 凋亡； 氯通道； 凋亡性细胞容积减小

蟾酥是一种名贵的中药，其含有多种化学成分，具有抗肿瘤、强心、镇痛、升压等多种药理活性。蟾酥对多种恶性肿瘤，如肝癌、胰腺癌、结肠癌、白血病等，均有较好疗效，对癌性疼痛亦有一定缓解作用，并可用于防治恶性肿瘤的复发和转移[1,2]。文献报道，蟾酥中含量较高、药理活性较强的蟾蜍内酯类成分单体-华蟾酥毒基 (又称华蟾毒精，cinobufagin，CBG) 对人肝癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞和白血病等人体肿瘤细胞增殖和凋亡都有抑制作用[1-3]，但其作用机制目前尚不明确。我们前文报道化疗药物顺铂抑癌作用机制之一是激活氯通道，诱导细胞凋亡[4]。本研究对华蟾酥毒基进行体外实验研究，观察其对鼻咽癌细胞凋亡的影响，研究其抗癌机制，探讨氯离子通道在华蟾酥毒基抗肿瘤中的作用。

材 料 和 方 法

1肿瘤细胞株

低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞常规培养于含10％小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640生长液中，置于37 ℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养，按常规方法传代。

2药品及试剂

氯通道阻断剂5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate (NPPB)为Sigma产品，NPPB用DMSO配制成100 mmol/L储存液，使用终浓度为 100 μmol/L，DMSO最高终浓度为0.2％。Hoechst 33342/PI荧光染料购自南京凯基生物科技发展有限公司。华蟾酥毒基(纯度为95％)由暨南大学药学院提供，用DMSO配制成1 mmol/L储存液，置于4 ℃保存，临用前用等渗灌流液稀释到终浓度。等渗灌流液渗透压为300 mOsmol /L，成分包括(mmol/L)：70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES 和140 D-甘露醇。用冰点渗透压计(Osmomat 030,Gonotec)检测渗透压。灌流液pH值用Tris液调到7.4。

3细胞容积测量

将细胞悬液滴在小玻片上孵育1 h使其贴壁。实验时将细胞玻片安放在特制浴槽中。在倒置相差显微镜(IX71,Olympus)下选择固定视野连续拍摄细胞图像。用数字式摄像机 (Retiga 4000R,QImaging) 连接相差显微镜与计算机，用Scion Image 图像分析软件(Scion Corporation)控制拍摄，每隔60s拍摄细胞图像1幅，分析和测量细胞体积。细胞容积经标准化处理。标准化细胞容积(standardization cell volume，Vst)按Vst=(Vt/Vo)×100 公式计算，其中Vt是实时测得的细胞容积，Vo是同一细胞在等渗条件下的平均容积。实验设立空白对照组、华蟾酥毒基组 (8 μmol/L)、华蟾酥毒基(8 μmol/L)与氯通道阻断剂NPPB(100 μmol/L)联合作用组，实验时先用等渗液灌流5 min，然后分别给予华蟾酥毒基或华蟾酥毒基与NPPB灌流50min,空白对照组不给任何处理。所有实验在室温(20-24 ℃)下进行，重复3 次。

4Hoechst33342染色检测细胞凋亡

实验分为正常对照组、低剂量华蟾酥毒基组(0.1 μmol/L)、中剂量华蟾酥毒基组(4 μmol/L)、高剂量华蟾酥毒基组(8 μmol/L)、NPPB 组(100 μmol/L)、NPPB(100 μmol/L)与华蟾酥毒基(8 μmol/L)联合作用组。24孔板培养， 1.1×105cells/well，药物作用48 h后丢弃原培养液，PBS洗涤2次，每次3 min，每孔加入Hoechst 33342 10 μL和1 mL PBS混匀液，3 7℃孵育10-15 min。PBS洗涤1次。各孔加入1 mL的Buffer A工作液,室温避光放置15 min。在倒置荧光显微镜下随机计数300个细胞，辨认凋亡细胞和活细胞，细胞核或细胞质内见浓染致密的颗粒状亮蓝色荧光者为凋亡细胞，呈弥散均匀的淡蓝色荧光者为活细胞，计算凋亡率。每组均设3个复孔，并重复3 次。

5膜片嵌全细胞法记录氯电流

用EPC-7膜片钳放大器(Heka,Lambrecht/Pfalz)记录单个鼻咽癌CNE/2Z的全细胞电流。使用外径为1.5 mm、内径为0.86 mm的硼硅酸盐毛细玻璃管，在微电极拉制器(PB-7)上分两步拉制微电极。微电极尖端的电阻5-10 MΩ。电流和电压信号用CED1401(CED，Cambridge)数字化(采样频率3 kHz),实验数据用EPC(CED,Cambridge)软件分析。电压钳制模式：细胞被钳制在0 mV,以0 mV、±40 mV、±80 mV顺序不断反复循环，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔4 s。细胞玻片安置在灌流槽中，实验在室温(20-24 ℃)下进行。

6统计学处理

结 果

1华蟾酥毒基诱导鼻咽癌细胞凋亡

在荧光显微镜下可见，正常对照组的细胞状态良好，少见凋亡和坏死细胞,荧光染料Hoechst 33342可以少许进入正常细胞，正常细胞核Hoechst33342着色的形态呈圆形，染色质分布均匀，染上淡蓝色，而在华蟾酥毒基(8 μmol/L)作用下，诱导细胞凋亡，表现为进入细胞的Hoechst 33342增多，荧光强度较高,部分细胞的核由于浓集而呈亮蓝色，有明显的凋亡小体出现，核染色质凝集及边聚化，部分核染色体碎片状，核呈固缩状或圆珠状，见图1。进一步分析显示，华蟾酥毒基浓度依赖性诱导细胞凋亡，华蟾酥毒基低、中、高剂量组作用48 h后，细胞凋亡率分别为(1.9±2.5)％、(27.9±2.5)％和(43.2±3.3)％。

Figure 1.Inhibition of cinobufagin-induced apoptosis by the chloride channel blocker NPPB (Hoechst 33342 fluorescent staining,×280).CBG: 8 μmol/L cinobufagin; CBG+NPPB: 8 μmol cinobufagin + 100 μmol/L NPPB.

2氯通道阻断剂抑制华蟾酥毒基诱导的细胞凋亡

在氯通道阻断剂NPPB(100 μmol/L)的单独作用下，细胞状态较好，细胞中的荧光较弱，染色质分布均匀，少见凋亡和坏死细胞。在加入华蟾酥毒基(8 μmol/L)的同时，联合应用氯通道阻断剂NPPB(100 μmol/L)，结果显示NPPB显著抑制华蟾酥毒基诱导的细胞凋亡。细胞凋亡小体较之单纯华蟾酥毒基组少，荧光强度也较弱,见图1，凋亡率从华蟾酥毒基组(43.2±3.3)％下降到(8.6±2.9)％，Plt;0.01，抑制率为80.1％。

3华蟾酥毒基诱导的凋亡性细胞容积减小

当细胞处于等渗液中，连续灌流55 min细胞容积和细胞形态基本稳定不变。而在细胞外灌流华蟾酥毒基后，细胞体积逐渐缩小，皱缩，部分细胞由圆形变为不规则状。图2显示了等渗液对照组和8 μmol/L华蟾酥毒基组细胞0、30、50 min时的细胞图像。图像分析结果表明，细胞受到华蟾酥毒基刺激50 min后，可检测到细胞容积缩小到加药前等渗对照值的(90.1±0.9)％。

4氯通道阻断剂抑制华蟾酥毒基诱导的凋亡性细胞容积减小

细胞外灌流氯通道阻断剂NPPB时，明显抑制华蟾酥毒基诱导的细胞容积减小，图3显示了对照组和药物作用前后55 min内细胞容积变化的连续过程。在华蟾酥毒基作用50 min时，细胞容积缩小至(90.1±0.9)％,Plt;0.01。华蟾酥毒基和NPPB联合作用50 min时细胞容积仅减小至(97.5±0.7)％，与华蟾酥毒基组相比差异显著(Plt;0.01)。氯通道阻断剂NPPB对华蟾酥毒基诱导的凋亡性细胞容积缩小的抑制率达(74.8±4.5)％，显著抑制华蟾酥毒基诱导的凋亡性细胞容积减小，见图3。本结果提示华蟾酥毒基可能通过激活细胞氯通道而诱导凋亡性细胞容积减小。

Figure 2.Cell images taken during the process of apoptotic volume decrease induced by cinobufagin.ISO: isotonic solution; CBG: 8 μmol/L cinobufagin.

Figure 3.Inhibition of cinobufagin-induced apoptotic volume decrease by the chloride channel blocker NPPB.CBG: 8 μmol/L cinobufagin; NPPB+CBG: 100 μmol/L NPPB +8 μmol/L cinobufagin±sE.n=6

5华蟾酥毒基可以激活CNE/2Z细胞上的氯通道

当细胞处于等渗液中，可以记录一个稳定且较小的氯电流,见图4A，当膜电位分别钳制于-80 mV和80 mV时，细胞平均电流密度分别为(-3.2±0.3)pA/pF和(3.5±0.3)pA/pF。用含5 μmol/L华蟾酥毒基的等渗液灌流细胞可以激活氯电流，细胞平均电流分别增大至(-71.1±7.7)pA/pF(钳制电压：-80 mV)和(66.9±6.2)pA/pF(钳制电压：80 mV)(Plt;0.01)。结果显示，华蟾酥毒基激活的氯电流无明显的外向或内向优势,见图4B。细胞外灌流氯通道阻断剂NPPB(100 μmol/L)可明显抑制华蟾酥毒基所激活的氯电流，见图4C。图4D和4E分别显示了华蟾酥毒基激活氯电流和NPPB抑制该电流的全过程以及不同处理时的电流-电压关系。

Figure 4.Cinobufagin-induced chloride currents.CBG: 5 μmol/L cinobufagin; CBG+NPPB: 5 μmol/L cinobufagin + 100 μmol/L NPPB.**Plt;0.01 vs ISO+CBG±sE.n=6.A: control; B: cinobufagin; C: cinobufagin+NPPB; D: the time course of inhibition of cinobufagin challenge-induced chloride currents by NPPB; E: current-voltage relationship.ISO: isotonic solution.

讨 论

用抗癌药进行化疗在肿瘤的综合治疗中占有极其重要的地位。抗癌药可通过诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖或/和诱导瘤细胞凋亡等不同环节而起抗癌作用。然而大多数实体瘤的治疗目前仍未能达到满意的效果。发现抗癌药物作用新靶点，从天然产物中寻找新的抗癌药物是药物研发工作的重点之一。

蟾酥为我国名贵中药,为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液,经加工干燥制成。蟾酥化学成分很复杂，在蟾酥近百种已鉴定结构的化学成分中,其中3种化合物包括蟾蜍灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基有较明显的体外抗肿瘤作用。文献报道，蟾酥对白血病、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤有显著的抗肿瘤作用，还能不同程度地防治化疗和放疗引起的白细胞下降，在肿瘤治疗中有较好的发展前景[1，2]。研究表明,蟾毒内酯类可能通过阻滞细胞周期进程，干扰癌细胞蛋白质合成等而起抗肿瘤作用[3,5]。但迄今为止，人们对蟾酥抗癌机制认识不深，因此限制了将蟾毒内酯类开发应用于临床癌症治疗。

CBG是蟾酥中的一种活性单体，实验证明其具有抗白血病和抗肝癌作用。微量的CBG可诱导白血病HL-60细胞凋亡,有显著的抑制生长作用[5]。CBG的抗癌作用机制可能是多方面的,诱导肝癌细胞周期G2/M期阻滞可能是CBG抑制肝癌细胞增殖的重要机制，CBG可使人肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞停滞于G2/M期,减少S期的细胞比例,减少肝癌细胞S期DNA含量及增殖指数,并诱导肝癌细胞凋亡[4,6]，提示CBG可能通过影响细胞周期进程而诱导细胞凋亡。本实验结果显示，CBG诱导鼻咽癌细胞凋亡，进一步证实了CBG的抗鼻咽癌作用,表明CBG是中药蟾酥的主要抗肿瘤成分之一。

我们前期的研究工作表明， Cl-通道在细胞周期调节、细胞增殖、凋亡和细胞迁移等重要生理病理过程中起重要作用[7-9]。鼻咽癌主要化疗药物-顺铂诱导的鼻咽癌细胞发生凋亡的早期，激活细胞膜Cl-通道[4,10]。近年来越来越多证据表明，Cl-通道的激活是细胞凋亡发生过程的一个交汇点，在细胞凋亡早期触发机制中发挥关键性作用。在凋亡早期，Cl-通道和K+通道被激活，引起Cl-和K+外流，同时伴随水的外流而导致凋亡性细胞皱缩，诱导细胞凋亡。Cl-通道和K+通道的激活是细胞凋亡性生化变化的上游事件，激活Cl-通道和K+通道，诱导细胞发生凋亡性容积减小是抗癌药作用的潜在的新靶点。蟾酥可否通过激活Cl-通道而诱导细胞发生凋亡？目前国内外尚没有相关的报道。为了研究Cl-通道在华蟾酥毒基抗肿瘤中的作用，本实验观察了华蟾酥毒基对氯通道的作用，以及阻断Cl-通道对华蟾酥毒基诱导凋亡和凋亡性容积减小作用的影响。结果表明，华蟾酥毒基可激活氯通道，氯通道阻断剂NPPB可以显著地抑制华蟾酥毒基诱导的氯电流，拮抗华蟾酥毒基引起的细胞凋亡性容积减小和细胞凋亡，提示华蟾酥毒基可能通过激活氯通道而诱导细胞凋亡，氯通道在华蟾酥毒基抗肿瘤中起重要作用。本实验的完成，加深了我们对华蟾酥毒基的抗癌机制的认识，为研发离子通道介导的蟾毒内酯类化合物抗肿瘤药物提供了新的实验依据。

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Rolesofchloridechannelsinapoptosisinducedbycinobufagininnasopharyngealcarcinomacells

BAI Zhi-quan1,LI Chun-ying1,LI Yuan2,MA Wen-bo1,ZHU Lin-yan2,YE Wen-cai3,ZHANG Dong-mei3,WANG Li-wei1,CHEN Li-xin2

(1DepartmentofPhysiology,2Departmentofpharmacology,SchoolofMedicine,3InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To investigate the roles of chloride channels in the apoptosis and apoptotic volume decrease(AVD) induced by cinobufagin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells.METHODSFive experimental groups in this study were set up,including control group,cinobufagin groups treated with low,medium or high concentration of cinobufagin alone,and the combination group treated with cinobufagin and the chloride channel blocker 5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) -benzoate (NPPB).Apoptotic rates were detected by Hoechst 33342 staining and the volume changes were measured by the method of time-lapse live cell imaging.The patch clamp technique was used to record whole-cell chloride currents.RESULTSCinobufagin induced apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells in a concentration-dependent manner.The apoptotic rate was 43.2％ in the cells treated with cinobufagin at high concentration (8 μmol/L).An AVD was observed in the cells treated with cinobufagin.Cinobufagin decreased the cell volume by 9.9％ in 50 min and activated a chloride current which did not show significant outward rectification.The chloride channel blocker NPPB inhibited the cinobufagin-induced apoptosis,AVD and chloride currents.NPPB decreased the cinobufagin-induced apoptosis and AVD by 80.1％ and 74.8％,respectively.CONCLUSIONOur findings suggest that cinobufagin induces apoptosis by activation of chloride channels,which may play an important role in the anti-tumour action of cinobufagin.

Cinobufagin; Apoptosis; Chloride channels; Apoptotic volume decrease

1000-4718(2011)05-0833-05

R739.63

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.001

2011-02-27

2011-04-19

国家自然科学基金资助项目 (No.30771106；No.30870567；No.30871267；No.90913020；No.U0932004)；广东省自然科学基金资助项目(No.07005974)

△通讯作者 Tel: 020-85220260；E-mail: wangliweic@sohu.com; Tel: 020-85228865；E-mail: chenlixinw@sohu.com

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