共轭亚麻酸甲酯化方法的比较和优化

袁高峰 陈小娥 李 铎

(浙江海洋学院食品与药学学院、医学院1，舟山 316000)

(浙江大学食品科学与营养系2，杭州 310029)

共轭亚麻酸甲酯化方法的比较和优化

袁高峰1，2陈小娥1李 铎2

(浙江海洋学院食品与药学学院、医学院1，舟山 316000)

(浙江大学食品科学与营养系2，杭州 310029)

气相色谱分析油脂和生物样品的脂肪酸时样品需要进行甲酯化，本研究以富含共轭亚麻酸(CLNA)的栝楼籽油为材料，针对共轭亚麻酸三酰甘油和共轭亚麻酸自由脂肪酸两种脂质形式进行了甲酯化方法的优化和比较。结果表明直接以栝楼籽油(三酰甘油形式)采用酸性催化的方法进行甲酯化，在高温和长时间的反应条件下，石榴酸(栝楼籽油含有的主要CLNA)严重异构为其他形式的CLNA，而碱性催化的方法进行甲酯化，55℃反应20 min既能使甲酯化完全，且石榴酸等CLNA保持稳定，适宜作为自由脂肪酸含量低的脂质的甲酯化方法。而对自由脂肪酸含量高的脂质可以采用先以0.3 mol/L氢氧化钾90%乙醇溶液37℃皂化裂解2 h，再采用1 mol/L硫酸甲醇溶液50℃反应10 min进行甲酯化。

共轭亚麻酸 气相色谱(GC) 甲酯化 碱催化 酸催化

油脂和生物样品的脂肪酸组成一般采用气相色谱(GC)来进行分析。通常，GC分析前，脂肪酸需要转换为它的衍生物。而脂肪酸GC分析中使用最多的脂肪酸衍生物为脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯一般通过酸性或者碱性方法催化而成。

共轭脂肪酸是对具有共轭双键体系的多不饱和脂肪酸位置和立体异构体的通称。共轭脂肪酸可以是双烯、三烯或四烯的形式，最常见的共轭脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，也就是共轭亚油酸(CLA)和共轭亚麻酸(CLNA)。由于其结构的特殊性，甲酯化过程中共轭脂肪酸容易产生异构，在高温条件下，含有共轭脂肪酸的脂质还会产生杂质。到目前为止，已经建立了几种适宜于CLA分析的方法［1－7］。

目前，已发现石榴酸(9c，11t，13c－ CLNA)、α －桐酸(9c，11t，13t－ CLNA)和梓树酸(9t，11t，13c －CLNA)等不同构型的CLNA广泛存在于植物种子种，研究报导CLNA具有细胞毒性、抑制癌症形成和改变脂代谢等功能。近来，随着CLNA越来越多的功能被发现以及其在体内能转化为CLA，引起了人们对CLNA研究的极大兴趣。但对CLNA的分析方面还少有报导。因此，本研究以栝楼(Trichosanthes kirilowii)籽(富含CLNA的脂质)为材料，比较不同的甲酯化方法对CLNA的影响，以期建立适宜于CLNA的甲酯化方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栝楼籽购于浙江长兴。

1.2 仪器

GC－14C气相色谱仪:日本岛津公司;DB－23毛细管柱进行(60 m ×0.25 mm i.d.，0.25 μm 膜厚度):美国安捷伦科技有限公司。

1.3 栝楼籽油的提取

根据 Floch 等［8］的方法以氯仿∶甲醇(2∶1)萃取。

1.4 共轭亚麻酸三酰甘油甲酯化方法

根据Park等［6］的方法设定反应方法和条件。

1.4.1 碱催化法

取25 mg纯化的栝楼籽油至特福纶试管中，先后加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol/L甲醇钠，往特福纶试管充氮气盖好盖子，充分振摇，置于水浴中甲酯化，分别设3个不同的反应温度(25、55和65℃)和两个不同的反应时间(5 min和20 min)。甲酯化反应结束后冷却到室温。

加入1 mL饱和盐水和2 mL正己烷，充分振荡，1 500 r/min的速度离心10 min。吸取上层液于一装有2 mL蒸馏水的干净试管中，振摇，静置后吸取有机相以无水硫酸钠吸取水分。

甲酯以Sep－Pak装置过滤，去除杂质后以氮气吹干，加入0.1 mL正己烷进行GC分析。

1.4.2 硫酸甲醇催化法

取25 mg纯化的栝楼籽油至特福纶试管中，先后加入1 mL甲苯和2 mL 1 mol/L硫酸甲醇溶液，往特福纶试管充氮气盖好盖子，充分振摇，置于水浴中甲酯化。甲酯化的条件为:4个不同的反应温度(50、60、80和100℃)和3个不同的反应时间(20、40和60 min)。甲酯化反应结束后冷却到室温，脂肪酸甲酯的清洗和过滤等步骤与碱催化法步骤(2)和(3)相同。

1.4.3 三氟化硼甲醇催化法

取25 mg纯化的栝楼籽油至特福纶试管中，先后加入1 mL甲苯和2 mL三氟化硼甲醇(BF3－CH3OH)溶液，往特福纶试管充氮气盖好盖子，充分振摇，置于水浴中甲酯化。甲酯化的条件为:3个不同的反应温度(50、60和80℃)和3个不同的反应时间(20、40和60 min)。甲酯化反应结束后冷却到室温，脂肪酸甲酯的清洗和过滤等步骤与碱催化法一样。

1.5 共轭亚麻酸的自由脂肪酸形式甲酯化

对自由脂肪酸含量高的脂质可以采取两步的方法进行甲酯化:先皂化裂解，再进行甲酯化。

1.5.1 栝楼籽油皂化和自由脂肪酸的制取

根据 Igarashi等［9］的方法进行，特福纶管里加90 mg栝楼籽油，加入0.3 mol/L KOH 90%乙醇溶液冲入氮气15 s，37℃下皂化2 h，冷却到室温后，再加入5 mL 90%的甲醇和15 mL正己烷，剧烈震荡，甲醇水相以15 mL正己烷萃取两遍以去除不皂部分物质，甲醇水相部分加入9 mL 6 mol/L的HCl后以15 mL正己烷提取两次，即得到自由脂肪酸。

1.5.2 甲酯化

皂化得到的自由脂肪酸采用硫酸甲醇催化法制取脂肪酸甲酯。取溶液1 mL至特福纶试管中，吹干后，先后加入1 mL甲苯和2 mL 1 mol/L硫酸甲醇溶液，往特福纶试管充氮气盖好盖子，充分振摇，置于水浴中甲酯化。甲酯化的条件为:两个不同的反应温度(50℃和60℃)和两个不同的反应时间(10 min和20 min)。甲酯化反应结束后冷却到室温，脂肪酸甲酯的清洗和过滤等步骤与碱催化法一样。

1.6 薄层层析(TLC)分析甲酯化的完成情况

用烧杯称取0.7 g硅胶，加入17 mL蒸馏水后搅拌均匀倒在20 cm×20 cm的玻璃薄层层析板上制备成薄层层析板。薄层层析板室温晾干，使用之前在100℃的烘箱60 min活化硅胶。点样后以石油醚∶乙醚(80∶20)作为展开剂展开30 min，取出晾干10 min后，喷硫酸铜显色剂100℃的烘箱显色30 min

1.7 气相色谱分析

脂肪酸甲酯采用带有火焰离子检测器的GC－14C气相色谱仪进行，数据采集和接收采用N2010色谱工作数据系统进行。脂肪酸的分离采用DB－23毛细管柱进行。色谱条件为:柱箱温度初始温度为100℃，保持3 min，以20℃/min的速率上升到190℃，保持10 min，然后以5℃/min的速率程序上升到215℃，保持6 min，最后以10℃/min的速率升温到230℃，保持5 min。载气为氮气，进样采用分流方式，进样口温度和检测器温度均保持在270℃。脂肪酸通过与标准脂肪酸混合物比较鉴定。

2 结果与分析

为了通过气相色谱法定量分析含有CLNA的油脂和生物样本，样本必须完全地甲酯化成为脂肪酸甲酯，且在甲酯化过程中不产生杂质，尽可能降低共轭亚麻酸异构化程度。而含有CLNA的油脂和生物样本根据其含有的脂质性质不同可以分为O－酰基脂质如三酰甘油或自由脂肪酸等，本研究以富含CLNA的栝楼籽为材料，针对共轭亚麻酸三酰甘油和共轭亚麻酸自由脂肪酸两种脂质形式进行甲酯化方法优化和比较。每一个甲酯化反应重复两次，各试验结果取两次反应的平均值计算。

2.1 共轭亚麻酸三酰甘油甲酯化方法比较

2.1.1 共轭亚麻酸三酰甘油硫酸甲醇催化法

通过TLC检验硫酸甲醇催化法甲酯化的完成情况表明:50℃反应40 min甲酯化不能完全;而延长反应时间或升高反应温度能使甲酯化反应完全:50℃反应60 min反应可以完全，60℃反应40 min也能反应完全。

表1为不同反应条件下硫酸甲醇催化法脂肪酸的组成。随着反应温度升高和反应时间的延长，异构化程度增加，在栝楼籽油中还检测到未知构型的CLNA，图1为硫酸甲醇催化法甲酯化典型的气相色谱图，从图1可以看出，随着反应温度升高和反应时间的延长，有新的未知结构的异构体出现;另外硫酸甲醇催化法甲酯化过程中还有杂质的出现。在一定的反应时间内，随着反应温度的提高，栝楼籽油中石榴酸的含量降低，而石榴酸的异构体(α－桐酸和梓树酸)含量增加，石榴酸与α－桐酸的比率降低(表1)，这表明硫酸甲醇催化法进行甲酯化随着反应温度升高，发生异构化的程度越严重。在一定的反应温度下，异构化的严重程度随反应时间而增加。

表1 硫酸甲醇催化甲酯化栝楼籽油脂肪酸组成(n=2)

图1 硫酸甲醇催化法甲酯化典型的气相色谱图(n=2)

2.1.2 共轭亚麻酸三酰甘油BF3甲醇催化法

通过TLC检验BF3－CH3OH催化法甲酯化的完成情况表明50℃反应长达60 min也不能完全完成，而在60℃下反应60 min甲酯化才能完全，提高反应温度到80℃时，反应也需要40 min反应才能完全。因为从硫酸甲醇催化法甲酯化的情况来看，酸催化法在100℃反应时异构化比较严重，BF3－CH3OH催化法甲酯化方法比较时，我们只调查50、60和80℃三个反应温度下的情况。

表2为BF3－CH3OH催化甲酯化时栝楼籽油脂肪酸组成情况。在一定的反应时间内，随着反应温度的提高，检测到的石榴酸含量显著降低;而对于α－桐酸来说，在一定的反应时间内在60℃含量最低，相应地石榴酸与α－桐酸的比率在60℃时最大;而梓树酸的含量也呈现增加趋势，虽然随着温度的升高α－桐酸和石榴酸与α－桐酸的比率的变化并没有像硫酸甲醇催化法甲酯化一样呈现有规律的变化，但总的趋势来说催化法BF3－CH3OH进行甲酯化随着反应温度升高，发生异构体的程度也越严重。

在一定的反应温度下，随着反应时间的延长，石榴酸的含量下降，其他CLNA的异构体含量增加，这表明随着反应时间的延长，异构化严重程度增加。随着反应温度升高和反应时间的延长，异构化程度的增加，在栝楼籽油中还检测到未知构型的CLNA，同时在BF3－CH3OH催化甲酯化过程中还检测到杂质的出现。

2.1.3 共轭亚麻酸三酰甘油碱法催化法

表3为栝楼籽油在不同反应温度和时间下甲醇钠碱法催化甲酯化时脂肪酸组成。与酸法甲酯化相比，碱法催化甲酯化对CLNA的异构化和氧化严重程度要小得多。25℃下反应20 min能使甲酯化反应完全，而与25℃相比，55℃下甲酯化反应石榴酸并不产生明显地异构体和氧化，随着温度升高，石榴酸异构化程度有所增加(表3)。因此，对含有磷脂、糖脂等成分的脂质，为确保反应完全，55℃反应20 min是理想的选择。

表2 3 3 催化甲酯化时栝楼籽油脂肪酸组成(n=2)

表3 碱催化法BF3－CH3OH催化甲酯化时栝楼籽油脂肪酸组成(n=2)

2.2 共轭亚麻酸自由脂肪酸形式的甲酯化

栝楼籽油经过皂化得到自由脂肪酸，栝楼籽油主要为三酰甘油，其皂化程度通过TLC检验，经过反应，栝楼籽油能完全皂化。

自由脂肪酸采取硫酸甲醇催化法进一步甲酯化，表4为不同反应条件下脂肪酸组成。50℃下反应5 min和10 min对CLNA的构型异构化影响较小，石榴酸的质量分数分别为32.00%和31.40%与碱法一步法甲酯化栝楼籽油的结果接近，而60℃下反应5 min使CLNA的构型严重异构化，石榴酸质量分数降低到26.38%;但TLC检验结果表明，50℃下反应5 min不能使甲酯化完全，而反应10 min后甲酯化能完全完成。因此对自由脂肪酸含量较高的脂质，采用两步法进行甲酯化是较为理想的选择，脂质皂化后采用硫酸甲醇在相对低的温度(50℃)反应相对短的时间(10 min)催化进行。

3 讨论和结论

自由脂肪酸能在过量的无水甲醇环境中以酸作为催化剂酯化形成甲酯，而O－酰基脂质如三酰甘油和磷脂等能在大量过量的无水甲醇环境中以酸作为催化剂通过转酯反应而形成甲酯。常见的酸性催化剂为硫酸，盐酸和BF3。而O－酰基脂质如三酰甘油等脂质还可以采用碱性催化的方法通过转酯反应生成甲酯，在无水甲醇环境中，以碱作为催化剂，三酰甘油、磷脂等可以迅速地转酯形成甲酯，反应的速度比酸性催化剂快得多，常用的碱性催化剂为甲醇钠，但自由脂肪酸不能采用这种方法来制备甲酯。

本研究以栝楼籽油(含有CLNA的脂质)为材料，比较研究酸催化法和碱催化法对CLNA的影响。研究结果表明直接以栝楼籽油(O－酰基脂质三酰甘油形式)采用酸性催化的方法进行甲酯化，在高温和长时间的反应条件下，石榴酸(栝楼籽油含有的主要CLNA)严重异构为其他形式的CLNA，而碱性催化的方法进行甲酯化，55℃反应20 min既能使甲酯化完全，且石榴酸等CLNA保持稳定，一般认为碱性催化法比酸性催化法提供更加稳定的反应条件［10］，本研究也证实了这一点。研究表明对于O－酰基脂质来说，碱性催化法优于酸性催化法，这与Igarashi等［11］采用不同甲酯化方法对α－桐酸进行甲酯化比较的研究结果以及 Park等［4，6］采用不同甲酯化方法对CLA比较的结果相一致。综合硫酸甲醇催化、BF3－CH3OH催化法甲酯化和甲醇钠碱法催化甲酯化的试验结果，CLNA由于结构的特殊性，含CLNA的三酰甘油不适宜采取酸法进行，酸法甲酯化需要在高温下长时间反应，这导致CLNA构型异构和氧化，并产生杂质，影响GC分析而不能精确定量分析CLNA的含量和组成。而甲醇钠碱法催化甲酯化能使三酰甘油和复杂脂质在相对低的温度和短的时间内完全甲酯化，且对CLNA的构型和含量影响较小，适宜作为自由脂肪酸含量低的脂质的甲酯化方法。

表4 两步法催化与碱催化甲酯化时栝楼籽油脂肪酸组成(n=2)

但是，碱性催化法不能催化自由脂肪酸的甲酯化，不能应用于自由脂肪酸的甲酯化。对于易于酯化的自由脂肪酸来说，在温和的反应条件(50℃，10 min)对CLA和CLNA的影响较小，可以作为甲酯化的方法［12］。因此，对自由脂肪酸含量较高的复杂脂质可以采取两步来进行:首先把复杂脂质皂化裂解为自由脂肪酸，然后采用1 mol/L硫酸甲醇溶液50℃反应10 min进行甲酯化。结果表明，采取两步法CLNA含量保持稳定，且不产生杂质，可以作为自由脂肪酸含量高的脂质甲酯化方法。

综上所述，对不同的含有CLNA的脂类样本通过GC进行定量分析时，应该根据CLNA的化学形式选择合适的甲酯化方法。对于自由脂肪酸含量低的脂质的甲酯化方法直接采用碱性催化的方法(0.5 mol/L甲醇钠甲醇溶液55℃反应20 min)进行甲酯化，而对自由脂肪酸含量高的复杂脂质可以采用先以0.3 mol/L氢氧化钾90%乙醇溶液37℃皂化裂解2 h，再采用酸性催化的方法(1 mol/L硫酸甲醇溶液50℃反应10 min)进行甲酯化。

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Comparison of Different Methylation Methods for Analysis of Conjugated Linolenic Acid

Yuan Gaofeng1，2Chen Xiao'e Li Duo2
(School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean Univisity1，Zhoushan 316000)
(Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University2，Hangzhou 310029)

The lipids should be methylated before analysis of fatty acid in oils and biological samples by the gas chromatography.Different methods for methylation of conjugated linolenic acid(CLNA)in the two chemical forms，free fatty acid(FFA)and triacylglycerol(TAG)were compared by using the Trichosanthes kirilowii seed oil，which was rich in CLNA.The punicic acid(the predominant form of CLNA in Trichosanthes kirilowii seed oil)was seriously isomerized into other CLNA isomers when the Trichosanthes kirilowii seed oil(CLNA in the form of TAG)was methylated by using acid catalyst.However，the Trichosanthes kirilowii seed oil could be completely methylated by 0.5 mol/L NaOMe/methanol at 55 ℃ for 20 min without isomerization of CLNA.The results showed that precise methylation methods should be chosen according to the chemical forms of CLNA.For lipids with negligible FFA，it could be methylated by 0.5 mol/L NaOMe/methanol at 55 ℃ for 20 min.For lipids with considerable content of FFA，it could be methylated by the following two steps:First，the lipids were hydrolyzed into FFA by 0.3 mol/L KOH/90%ethanol at 37℃ for 2 h;second，the FFA was methylated by 1 mol/L H2SO4/methanol at 50℃ for 10 min.

conjugated linolenic acid，gas chromatography(GC)，methylation，acid catalyst，base catalyst

TS207.3

A

1003－0174(2011)10－0070－06

浙江海洋学院科研启动经费资助项目(21135010910)

2010－12－12

袁高峰，男，1978年出生，讲师，博士，食品营养与安全