共轭亚油酸对脂肪代谢相关基因表达的影响

李杰梅，徐娟娟，杨得坡，陈家树，3*

1中山大学新华学院，广州510520; 2中山大学药学院天然药物与中药研究所，广州510006;3中山大学医学院，广州510080

共轭亚油酸对脂肪代谢相关基因表达的影响

李杰梅1，徐娟娟1，杨得坡2，陈家树1，3*

1中山大学新华学院，广州510520;2中山大学药学院天然药物与中药研究所，广州510006;3中山大学医学院，广州510080

本文利用实时定量PCR的测定方法，分析了两种共轭亚油酸(CLA)异构体对3T3-L1小鼠前脂肪细胞脂肪代谢相关基因表达的影响。本研究CLA异构体的处理浓度和时间为75.4 μmol/L，8 d，测定了与能量代谢、细胞凋亡、脂肪酸氧化作用和脂解作用相关的多种基因的mRNA水平。结果显示:两种异构体均能够显著提高UCP1、UCP3、Perilipin和PPARα的mRNA水平，而抑制UCP2的表达水平(P＜0.01)。与cis-9，trans-11 CLA相比，trans-10，cis-12 CLA显著提高PKA(P＜0.05)、CPT-1和TNF-α(P＜0.01)的mRNA水平。与对照组相比，两种CLA异构体处理组均对HSL、ATGL、ACO和Leptin的基因表达无显著影响。

共轭亚油酸;异构体;荧光定量PCR;3T3-L1

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亚油酸的一组位置和几何异构体的通称，其中 cis-9，trans-11和trans-10，cis-12 CLA是两种常见CLA异构体，此两者都是天然产物，其中cis-9，trans-11CLA是饮食CLA的主要形式。CLA具有抑癌、减肥、调节血脂、抗动脉粥样硬化、免疫调节等多种生理功能［1-4］。

目前应用最广泛的前脂肪细胞系是3T3-L1、3T3-F442和Ob17，它们均是体外实验的理想研究对象。本文选择3T3-L1细胞作为研究CLA异构体降脂作用的实验材料。在以往的研究报道中，以CLA处理细胞的时间较短(1～3 d)，而常见的有效处理浓度为50 μmol/L及100 μmol/L［5-7］，本研究以75.4 μmol/L的CLA进行处理，并通过实时定量PCR(quantitative real-time reverse transcriptase PCR，RT-PCR)分析相应mRNA水平的变化，目的是研究两种CLA异构体对能量代谢、细胞凋亡、脂肪酸氧化和脂解作用相关基因的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

CLA单体 (cis-9，trans-11和 trans-10，cis-12 CLA)，纯度为98%，购自南昌华兴生物科技有限公司。3T3-L1细胞株由中山大学生科院寄生虫学研究室提供，为第7～8代细胞。

主要试剂:DMEM培养基、胎牛血清、DMSO、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素均为Sigma公司产品;提取总RNA的TriZol试剂为美国Invitrogen公司产品;逆转录试剂Oligo-dT、dNTPs由大连宝生生物工程有限公司提供;逆转录酶M-MLV为Promega公司产品;SYBR Green PCR Master Mix为Toyobo公司产品。

主要仪器:CO2培养箱(Thermo Electron公司); BioPhotometer 6131型核酸蛋白检测仪 (德国Eppendorf公司);PTC-200 PCR仪(A＆B公司);ABI prism 7900型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。

1.2 细胞培养方案

3T3-L1前脂肪细胞的培养方法:以培养孔数为12的细胞培养板培养细胞，培养液是含有10%胎牛血清的DMEM溶液，在温度为37℃、含5%CO2的培养箱中培养至细胞融合。细胞融合两天后，换以含有0.1 μmol/L地塞米松、1 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 μmol/L胰岛素、10%胎牛血清的DMEM培养基，刺激分化，培养48 h，并把加入诱导分化液当日设为第0 d。之后撤去3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和地塞米松，使完全培养液中只含有0.1 μmol/L胰岛素;2 d后撤去胰岛素，使用不含有任何诱导剂的完全培养基。

以DMSO分别溶解CLA两异构体，均配制成药物浓度为75.4 μmol/mL的储备液。每孔培养液的溶液量为2 mL，加入CLA储备液的量为2 μL，则加入到处理组的细胞培养液中时，CLA异构体的最终浓度为75.4 μmol/L，同时DMSO在细胞培养液的最终浓度仅为0.1%。从第2 d至第10 d，每天换液，对照组则加入相同体积、不含CLA的DMSO溶液，每个处理组均含有6个重复。倒置显微镜下观察前脂肪细胞分化情况，提取RNA用作实时荧光定量PCR分析，CLA对脂肪细胞的影响作用通过与空白对照组比较而得出。

1.3 引物和探针的设计合成

引物由上海申能博彩生物科技有限公司负责设计并合成，引物序列等情况见表1。

表1 试验基因的引物设计Table 1 Primers for RT-PCR

1.4 组织样品总RNA的提取

采用Trizol法。

1.5 总RNA纯度及浓度的测定

采用BioPhotometer 6131型核酸蛋白检测仪，在OD260 nm下测定RNA的纯度及浓度，选择吸光度比值OD260 nm/OD280 nm＞1.9的总RNA进行试验。

1.6 组织样品cDNA合成和检验

取5 μL RNA工作液，加入3 μL Oligo-dT，加入12 μL DEPC处理水至20 μL;70℃变性5 min后，立即冰浴2 min，再与逆转录体系中其他物质混合，加入5×RT Buffer 10 μL，dNTPs(10 mmol)3 μL，M-MLV 2 μL，RNasin 0.6 μL，补充DEPC水至总体积为50 μL。

逆转录反应的PCR条件为:42°C 50 min，70°C 10 min，4°C 5 min。取出后短暂离心，cDNA置-20℃保存。为检验样品cDNA，用小鼠β-actin的引物进行PCR扩增，以1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ mL EB)电泳检测PCR产物，如图所示，扩增条带长度约为500 bp，与文献［8］报道的结果相似。

图1 β－actin的PCR扩增结果Fig.1 PCR analysis of β－actin

1.7 实时荧光定量PCR反应

20 μL反应体系中含有模板cDNA 1 μL，SYBR Green PCR Master mix 10 μL，sense-primer 0.5 μL，anti-sense-primer 0.5 μL，RNAase-free水8 μL，循环参数为:95℃10 min;95℃15 s，60℃1 min，40个循环。反应结束后做产物的熔解曲线分析，检验PCR产物的特异。以β-actin作为内参，根据被测基因与内参基因的 Ct差值，以对照组的表达量为100%，以相对量的方式表示。

1.8 数据处理及统计分析

被测基因的相对定量按公式得出:被测基因 = 2—(△△Ct)，其中△△Ct=(△Ct，Q)—(△Ct，C)。△Ct，Q为处理组被测基因的Ct值与管家基因Ct值之差;△Ct，C为对照组被测基因的Ct值与管家基因Ct值之差。测定△Ct值以±s表示，以SPSS软件进行统计分析，组间差异采用成组t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

观察前脂肪细胞分化情况:倒置显微镜下观察，分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，胞浆内无脂滴，对照组分化后细胞呈圆形，胞浆内可见大量的脂滴，脂滴聚集于核周。诱导分化后第10 d，对照组3T3-L1前脂肪细胞90%呈脂肪细胞表型。cis-9，trans-11处理组细胞观察结果与对照组接近，trans-10，cis-12 CLA处理组则有明显变化，细胞体积明显较小，说明前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的过程受到了抑制。

实时荧光定量PCR的分析结果见图2和表2。

cis-9，trans-11 CLA处理组中，UCP1、UCP3和PPARα的mRNA表达量比对照组增加一倍 (P＜0.05)，Perilipin的表达量则增加64%(P＜0.05)。UCP2的mRNA表达水平极显著降低(P＜0.01)，仅为对照组的31.3%。其余基因的mRNA表达量并未受cis-9，trans-11 CLA显著影响。

trans-10，cis-12 CLA对脂类代谢相关基因的mRNA表达有更大的影响。UCP1的mRNA表达量比对照组增加了4.39倍，UCP3、PPARα和Perilipin的mRNA水平则分别增加了5.86倍、5.3倍和5.57倍，以上的变化极其显著(P＜0.001)，而UCP2的mRNA表达水平减少为对照组的1/4(P＜0.01)。trans-10，cis-12异构体使CPT-1和TNF-α的mRNA水平分别提高到对照组水平的2.82和3.62倍(P＜0.01)，同时也使PKA的mRNA表达增加了73.6 %(P＜0.05)。但是，trans-10，cis-12 CLA对于HSL、ATGL、ACO和Leptin表达的影响却不显著。

图2 脂肪细胞的RT－PCR分析结果Fig.2 mRNAs levels of 3T3－L1 cells by RT－PCR

3 讨论

解偶联蛋白(UCPs)与机体能量平衡的调控密切相关，尤其是已证实UCP1基因的上调能提高机体能量代谢［9］。本研究中两种CLA异构体处理组中，UCP1、UCP3基因表达增加，而UCP2的mRNA水平降低，并且trans-10，cis-12 CLA(P＜0.001)的影响强于cis-9，trans-11 CLA(P＜0.01)。trans-10， cis-12 CLA使UCP1的mRNA表达量增加的作用与LaRosa等所报道的结果相同［10］。

表2 脂肪细胞的RT-PCR分析结果Table 2 mRNA levels of 3T3-L1 cells by RT-PCR

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)表达的增加能上调脂酰辅酶A氧化酶(ACO)和肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)的表达，因此，PPARα的激活程度反映了脂肪酸β-氧化的程度［11］。本研究中，CLA的两种异构体均能上调PPARα的mRNA水平，并且相较而言，cis-9，trans-11 CLA的影响程度较小(P＜0.01)，trans-10，cis-12 CLA的影响程度较大(P＜0.001)。CPT-1基因表达上调在trans-10，cis-12 CLA处理组中较为明显(P＜0.01)。而对于脂酰辅酶A，两种异构体均趋于抑制ACO的表达。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种已知能明显抑制脂肪细胞分化、促进脂水解和脂肪细胞凋亡的细胞因子［12］，而且TNF-α的水平会因为CLA的处理而增加［13］。本研究得到相似的结果，TNF-α表达水平的提高仅在trans-10，cis-12 CLA处理组中出现(P＜0.01)，因此脂肪细胞的凋亡也很可能发生在trans-10，cis-12 CLA处理组中。但是，仅有TNF-α表达水平的上升还不能直接说明 trans-10，cis-12 CLA具有促凋亡作用，还需要继续研究其他与细胞凋亡周期相关的细胞因子的情况。

一般而言，TNF-α对Leptin的表达具有促进作用，后者能上调与脂肪酸氧化相关酶类以及其转录因子的表达、诱导脂细胞凋亡。但实验结果和以往的报道一样［14］，显示trans-10，cis-12 CLA具有减少Leptin mRNA表达水平的倾向。即在处理组中出现了TNF-α和Leptin基因表达水平变化并不一致的情况，Leptin的表达水平显然受到了其他因素的影响。

脂周包被蛋白(Perilipin)在油滴表面起屏障作用，磷酸化后屏障作用消失，加速激素敏感脂酶(HSL)从胞浆向脂滴转位，进而促进甘油三酯水解［15］。蛋白激酶A(PKA)对Perilipin和HSL均有磷酸化作用，磷酸化的Perilipin和HSL能促进脂解作用［16］。作为一种重要的新脂酶，脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)主要参与水解甘油三酯的第一步。PKA、Perilipin、HSL和ATGL基因均和脂解作用有关，分析这些基因mRNA表达水平的数据，发现长时间以高剂量的trans-10，cis-12CLA能提高PKA(P＜0.05)和Perilipin(P＜0.001)的表达水平，而对HSL和ATGL无明显影响。cis-9，trans-11 CLA除能提高Perilipin(P＜0.05)的表达水平外，对其余三种基因均无明显影响。

综上所述，通过实时荧光定量PCR比较两种异构体对与脂肪酸代谢相关基因表达水平的影响，初步判断cis-9，trans-11 CLA对脂肪细胞能量代谢具有促进作用，但是不影响细胞凋亡、脂肪酸氧化和脂解作用。而trans-10，cis-12 CLA虽然对脂解作用无明显影响，但是却对能促进与能量代谢、诱导细胞凋亡和脂肪酸氧化相关基因的表达。

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Effects of Conjugated Linoleic Acid Isomers on Gene Expression of Proteins Involved in Lipid Metabolism

LI Jie-mei1，XU Juan-juan1，YANG De-po2，CHEN Jia-shu1，3*1Xinhua College of Sun Yat-sen University，Guangzhou，510520，China;2Institute of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou，510006，China;3School of medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China

RT-PCR was employed to determine isomer-specific effects of two conjugated linoleic acid(CLA)isomers on enzymes involved in lipid metabolism in cultured 3T3-L1 adipocytes.Concentration of either isomer was 75.4 μmol/L and treatment period was 8 days.mRNA levels of proteins involved in energy expenditure，apoptosis，fatty acid oxidation and lipolysis were identified.The results showed that gene expression of UCP1，UCP3，Perilipin and PPAR increased whereas UCP2(P＜0.01)reduced for both CLA isomers.And compared with treatment of cis-9，trans-11 CLA，trans-10，cis-12 CLA significantly up-regulated mRNA levels of PKA(P＜0.05)，CPT-1 and TNF-α(P＜0.01).Compared with control，both isomers did not significantly influence gene expression of HSL，ATGL，ACO and Leptin.

conjugated linoleic acid;isomer;quantitative real-time reverse transcriptase PCR;3T3-L1

1001-6880(2011)04-0704-05

2010-09-06 接受日期:2010-12-13

*通讯作者 Tel:86-20-87065055;E-mail:mary1102357@hotmail.com

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