发芽燕麦不同溶剂提取液抗氧化活性的比较*

付晓燕，李海龙，杨超，谢笔钧，孙智达

1(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉，430070)2(华中农业大学楚天学院食品与生物科技学院，湖北武汉，430205)

发芽燕麦不同溶剂提取液抗氧化活性的比较*

付晓燕1，2，李海龙1，杨超1，谢笔钧1，孙智达1

1(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉，430070)2(华中农业大学楚天学院食品与生物科技学院，湖北武汉，430205)

将燕麦种子进行发芽，对未发芽原样、发芽6 d的籽粒、芽和根分别用体积分数80%的甲醇、乙醇和丙酮溶液提取其多酚，测定了不同溶剂提取液的总酚提取率、清除DPPH·自由基的能力、还原能力以及清除亚硝酸盐的能力，并对其差异性及相关性进行了分析。结果表明:发芽前后燕麦多酚均具有较强的清除DPPH·自由基的能力及较强的还原能力，对亚硝酸盐也具有一定的清除作用。不同溶剂提取液的抗氧化活性与其总酚种类和极性密切相关，发芽在一定程度上提高了燕麦的抗氧化活性。

燕麦，发芽，多酚，抗氧化活性

燕麦属禾本科植物，是世界主要农作物之一，在世界八大粮食作物中，总产量居第五位。我国燕麦的种植面积不大，主要产区分布在内蒙古、山西、河北等地。燕麦被认为是谷物食品中最好的全价营养食品，具有营养与保健双重功效［1－2］。

抗氧化活性是燕麦诸多生理功能中较为突出的一个，燕麦中含有多种抗氧化成分，如植酸、甾醇、VE等，最主要的抗氧化成分是酚类物质［3］。研究表明，燕麦中的酚类物质主要包括各种酚酸、燕麦蒽酰胺和黄酮类化合物等，其中燕麦蒽酰胺是燕麦中所特有的酚类物质，它由一系列羟基肉桂酸及其衍生物和邻氨基苯甲酸及其衍生物通过酰胺键(—HNCO—)相连而成［4］。

种子萌发涉及到一系列形态上和生理生化的变化，营养成分含量的增加和生物利用率的提高，抗营养因子的不利因素被减弱或消除这些现象在开发芽类食品方面受到了人们的关注［5］。目前对于燕麦发芽的研究主要集中在发芽过程中三大营养素及其相关酶活性的变化方面，对发芽燕麦酚类物质的研究相对较少。本实验对发芽燕麦不同溶剂提取液的总酚提取率及抗氧化活性进行了比较，旨在为燕麦的深度开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

晋燕八号裸燕麦，由山西省农科院高寒作物研究所提供。

Folin-Ciocalteau试剂和DPPH·自由基(Sigma公司);甲醇、乙醇、丙酮、没食子酸、碳酸钠、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、盐酸、亚硝酸钠、对氨基苯甲酸、盐酸萘乙二胺等试剂均为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器和设备

250B生化培养箱，江苏金坛市宏华仪器厂;多功能食品粉碎机，飞利浦家庭电器有限公司;AC 210S电子天平，美国Sartorius Instrument Ltd;SHZ－82A恒温水浴振荡器，国华仪器厂;755B分光光度计，上海精制科学仪器厂;TDL－5离心机，上海安亭科学仪器厂;FD-1-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 燕麦种子发芽

将燕麦种子用2%次氯酸钠溶液于室温下浸泡15 min，洗去残余的次氯酸钠溶液，用蒸馏水浸渍种子于18℃生化培养箱中浸泡16～18 h，将种子沥干后置于自制发芽盘中于18℃培养箱中连续发芽6 d，培养箱保持湿度在95%以上。将发芽6 d的燕麦分为籽粒、芽和根3部分，于冷冻干燥机中干燥36 h以待后续实验用。

1.3.2 燕麦多酚的提取

准确称取一定量的样品粉末(包括未发芽原样、6 d籽粒、6 d芽和6 d根)于带塞三角瓶中，按料液比1∶40(g∶mL)分别加入体积分数80%的甲醇、乙醇和丙酮溶液，置于50℃水浴摇床中提取2 h，提取结束后抽滤，将提取液于旋转蒸发仪上回收有机溶剂，浓缩样品，样品定容后以10 000 r/min离心10 min，制得不同溶剂的多酚提取液，用于测定总酚含量及抗氧化活性。

1.3.3 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteau法［6］，准确吸取待测液0.1 mL，依次加入6 mL蒸馏水，0.5 mL Folin-Ciocalteau试剂，混匀后加入20%的Na2CO3溶液1.5 mL，充分混匀，定容10 mL，在室温下静置1 h后于765 nm下测定其吸光度。总酚提取率(mg/g)以没食子酸当量表示。

1.3.4 清除DPPH·自由基能力的测定

采用 Amelie Fagerlund［7］等人报道的方法，取不同浓度的样品溶液2.0 mL和2×10－4mol/L的DPPH·自由基乙醇溶液2.0 mL，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温避光反应30 min后于517 nm处测其吸光度，计算燕麦多酚对DPPH·自由基的清除率，公式如下:

清除率/%= ［1－(Ai－Aj)/A0］×100

式中:A0为对照组吸光度;Ai为样品组吸光度;Aj为空白组吸光度。

1.3.5 还原能力的测定

采用Qing Liu［8］等人报道的方法，取不同浓度的样品溶液1.0 mL，加入0.2 mol/L，pH值6.6的磷酸钠缓冲液1.0 mL及1%的铁氰化钾溶液1.0 mL，于50℃水浴反应20 min后急速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液1.0 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.0 mL及0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混合均匀，10 min后于700 nm处测定其吸光度，吸光值越大表示还原能力越强。

1.3.6 清除亚硝酸盐能力的测定

采用郭艳华［9］等人报道的方法，取不同浓度的样品溶液1.0 mL，加入pH值3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液2.5 mL，再加入100 mg/kg的NaNO2溶液0.5 mL，用蒸馏水定容到5.0 mL，37℃恒温1 h。然后取反应液1.0 mL，加入0.4%的对氨基苯磺酸2.0 mL与0.2%的N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液2.0 mL，摇匀放置15 min后，于540 nm处测其吸光度，根据以下公式计算NaNO2的清除率:

清除率/%= ［1－(Ai－Aj)/A0］×100

式中:A0为对照组吸光度;Ai为样品组吸光度;Aj为空白组吸光度。

2 结果与讨论

2.1 发芽前后不同溶剂对总酚提取率的影响

在前期的研究中发现，燕麦种子发芽过程中总酚含量呈上升趋势，且芽和根中总酚相对含量明显高于籽粒，发芽6 d以后总酚含量的增幅逐渐减小，故选择发芽6 d的样品作为研究对象。

由图1可以看出，原样、6 d籽粒和根中3种溶剂总酚提取率为甲醇＞乙醇＞丙酮，而芽中则恰恰相反。一般认为游离的多酚存在较多的未被结合的游离态酚羟基并且易溶解于甲醇、乙醇等极性溶剂中［10］，由于丙酮属于中等极性溶剂，因此可以推测出燕麦种子发芽后不同部位的多酚极性存在差异，籽粒和根中的酚类物质极性较大，而芽中有相当数量中等极性的酚类物质。

图1 发芽前后不同溶剂提取液的总酚提取率

表1 不同溶剂总酚提取率差异性分析(平均值±标准差)1)

2.2 发芽前后不同溶剂提取液清除DPPH·自由基能力的比较

DPPH·是一种化学性质较为稳定的以氮为中心的自由基，不易被清除，若受试物能够清除它，则表示受试物具有较强的自由基清除能力［11］。其主要原理是测定反应混合物517 nm处吸光值的降低，因为DPPH·有个单电子，当接受供试物的电子或氢自由基后，形成稳定的抗磁分子，原517 nm处的吸光值明显减小，色泽由紫变黄［12］，其颜色变得越浅表明供试物的抗氧化能力越强。样品对DPPH·自由基的清除能力一般以IC50值表示，IC50值越小表明样品的抗氧化能力越强。

由图2可以看出，在测定的浓度范围内，样品对DPPH·自由基的清除作用随着其浓度增大而增强。由表2(以总酚浓度计，下同)可见，4个样品中不同溶剂提取液对DPPH·自由基的清除能力均呈现显著性差异，在6 d籽粒和芽中，丙酮、乙醇和甲醇提取液的清除能力呈递减趋势，而原样中乙醇提取液的清除能力最弱，根中反而最强。这说明不同部位抗氧化物质的种类和极性不同，导致不同溶剂提取液中抗氧化物质的种类和量均有所差异，最终表现在清除DPPH·自由基能力的强弱上。

观察发芽前后IC50值的变化，可以看出籽粒的乙醇提取液清除DPPH·自由基的能力较原样有所提高，甲醇和丙酮提取液的清除能力均略有下降，根的3种溶剂提取液清除能力普遍较强，而芽相对较差，这在一定程度上说明芽中富含的中等极性酚类物质抗氧化活性较差。

图2 发芽前后不同溶剂提取液清除DPPH·自由基的能力

表2 不同溶剂提取液清除DPPH·自由基的IC50值(平均值±标准差)

2.3 发芽前后不同溶剂提取液还原能力的比较

研究表明，抗氧化剂的还原力与其抗氧化活性之间存在联系，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而使自由基变为稳定的分子，从而失去活性［11］。通常以吸光值达0.5时所需试样的浓度(EC50)来衡量其还原能力的强弱，EC50值越小表明试样还原能力越强，抗氧化性也越强。

由图3可以看出，随着试样浓度的增加，其吸光值增大，但不同溶剂提取液的还原能力存在一定差异(表3)。值得注意的是，原样和6 d籽粒中，3种溶剂提取液还原能力的大小与清除DPPH·自由基的能力呈一定的正相关性，即试样清除DPPH·自由基的能力愈强，则其表现出愈强的还原能力，而芽和根中二者呈负相关。上述现象可能是由于燕麦发芽后不同部位中的抗氧化物质供氢和供电子相对能力的强弱差异所致，这也与不同部位抗氧化物质的种类和极性密切相关。

观察发芽前后EC50值的变化，可以看出发芽后籽粒的3种溶剂提取液其还原能力均较相应的原样提取液有所下降，而芽和根的提取液还原能力普遍较强，根略强于芽。

图3 发芽前后不同溶剂提取液的还原能力

表3 不同溶剂提取液还原力的EC50值(平均值标准差)

表3 不同溶剂提取液还原力的EC50值(平均值标准差)

EC50/( μg·mL－1)甲醇 乙醇 丙酮原样 28.77±0.224a50.37±0.130b13.12±0.121c 6 d籽粒 53.99±0.090a51.23±0.031b32.66±0.062c 6 d芽 18.05±0.460a19.50±0.207b20.09±0.169b 6 d根 17.96±0.372a18.77±0.218b17.39±0.357a

2.4 发芽前后不同溶剂提取液清除亚硝酸盐能力的比较

亚硝酸盐与胺类化合物在酸性环境或细菌作用下容易形成N-亚硝基化合物(NC)，NC能引起人体和动物的肝脏等多种器官的恶性肿瘤，是最令人类关注的一类化学致癌物质［13］。清除体内亚硝酸盐是阻断NC合成的有效途径，从而达到防癌的目的。

图4 发芽前后不同溶剂提取液清除亚硝酸盐的能力

由图4可以看出，燕麦发芽前后不同溶剂提取液均具有一定的清除亚硝酸盐的能力，且随着样品浓度的提高，清除效果逐渐增强，3种溶剂提取液清除效果的差异见表4。将表4与表2、表3综合比较可以难发现，4个样品中不同溶剂提取液清除亚硝酸盐的能力与其清除DPPH·自由基的能力和还原能力均呈现一定的相关性，这说明提取液清除亚硝酸盐的能力与其中抗氧化物质供氢和供电子的能力存在一定的内在联系。由于燕麦中的抗氧化成分组成复杂，其防癌的有效成分可能也并不止一种。

观察发芽前后IC50值的变化，可以看出发芽后籽粒、芽和根的3种溶剂提取液清除亚硝酸盐的能力都较相应的原样提取液明显提高，这说明发芽可以作为一种提高燕麦防癌功效的手段，为燕麦发芽食品的研究和开发提供了一定思路。

3 结论

实验结果表明，燕麦发芽后籽粒、芽和根中酚类物质的种类和极性不同，从而导致甲醇、乙醇和丙酮提取液的总酚提取率存在差异，进而表现在不同溶剂提取液抗氧化活性的强弱上。发芽前后燕麦多酚对DPPH·自由基均具有较强的清除效果，并具有较强的还原能力，对亚硝酸盐也具有良好的清除作用。不同溶剂提取液在3个反应体系中的作用有一定的相关性，原样和6 d籽粒中，3种溶剂提取液的还原能力与清除DPPH·自由基的能力正相关，与清除亚硝酸盐的能力负相关;而芽和根中，3种溶剂提取液的还原能力与清除DPPH·自由基的能力负相关，与清除亚硝酸盐的能力正相关。

燕麦发芽后，根提取液在3个体系中均表现出较强的活性，芽提取液除还原能力高于籽粒外，清除DPPH·自由基和亚硝酸盐的能力均相对较弱，由此推测芽中富含的中等极性酚类物质可能并不是关键的活性物质。值得关注的是，发芽在一定程度上提高了燕麦的抗氧化活性，并大大提高了燕麦的防癌功效，为燕麦功能食品的开发提供了一定依据。

此外，燕麦抗氧化活性的强弱可能也与酚类物质以外的某些抗氧化成分有较大关系，因此有必要对提取液进一步纯化，从而深入了解燕麦抗氧化活性与其中各种抗氧化物质之间的内在联系。

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Comparison of Antioxidant Activity for Different Solvents Extracts from Germinationed Oat

Fu Xiao-yan1，2，Li Hai-long1，Yang Chao1，Xie Bi-jun1，Sun Zhi-da1

1(College of Food Science and Technology Huazhong Agricultural University，Wuhan，430070，China)2(College of Food ＆ Biology Science and Technology，Chutian College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430205，China)

Oat seeds were steeped and germinated.Polyphenol compounds were extracted by 80%methanol，ethanol and acetone solvent respectively from non-germination oat，germinated seed，bud and root after 6 d＇s germination.Total phenolic yield，reducing power，scavenging activity to DPPHo radical and nitrite have compared.The results indicated that oat polyphenols had strong reducing power and scavenging effects to DPPHo radical and nitrite in both germinated and non－germinated seeds.The antioxidant activity of different solvents extracts was closely related to the kind and polarity of oat polyphenols.The antioxidant activity was higher in the germinated seeds.

oat，germination，polyphonols，antioxidant activity

硕士研究生(孙智达教授为通讯作者)。*"十一五"国家科技支撑计划项目(2006BAD27B09)

2010－11－21，改回日期:2011－02－15