太行山猕猴种群mtDNA遗传多样性研究

谢东明, 路纪琪, 王建东

(1.郑州大学 生物多样性与生态学研究所 河南 郑州 450001；2.太行山猕猴国家级自然保护区济源管理局 河南 济源 454650)

太行山猕猴种群mtDNA遗传多样性研究

谢东明1, 路纪琪1, 王建东2

(1.郑州大学 生物多样性与生态学研究所 河南 郑州 450001；2.太行山猕猴国家级自然保护区济源管理局 河南 济源 454650)

2007年11月～2008年2月，利用非损伤性取样法，在太行山猕猴国家级自然保护区采集到3个地理单元、5个野生种群猕猴个体的粪便样品，并从22份样品中提取到DNA，在此基础上，分析和探讨了野生太行山猕猴种群的遗传多样性状况及种群遗传结构.结果表明：①在341 bp的mtDNA控制区序列中发现11个变异位点，其中转换和颠换的位点分别为9个和2个；②在3个地理单元中，共定义了9种单倍型；③AMOVA分析结果表明，88.02%和11.03%的遗传变异分别发生在各地理单元间和各种群间，而地理单元内的各种群间的遗传变异仅占0.95%，且济源、焦作和新乡3个地理单元间存在着显著的遗传分化(P<0.01),无共享单倍型；④济源黄楝树种群具有最多的单倍型数(3),最高的单倍型多样性(0.833),最高的核苷酸多样性(0.002 93)和最高的平均核苷酸差异数(1.000).因此，从保护物种基因多样性的角度考虑，建议自然保护区管理部门将该种群列为优先保护单元.

猕猴(Macacamulatta)； 线粒体DNA； 遗传多样性； 太行山

0 引言

濒危物种的种群遗传多样性研究对合理、科学地制定保护策略有十分重要的意义.但是，由于研究样品(尤其是动物样品)的采集困难，导致相关信息的获得十分有限，从而制约种群遗传多样性研究的发展[1].这一困难随着技术的不断进步而得以解决.采用 mtDNA 多态性分析方法，可从分子层面了解群体的遗传多样性信息，还可结合宏观生态学深入探讨形成该物种独特遗传结构的地理、气候和历史原因[2].因此，mtDNA是一种非常实用的遗传标记方法[3].

猕猴(Macacamulatta)，别名恒河猴、黄猴、广西猴，隶属于猴科(Cercopithecidae)猕猴属，是国家二级重点保护野生动物.分布于太行山区的猕猴常被称为太行山猕猴，为猕猴华北亚种(M.m.tcheliensis)，也是我国特有的一个猕猴亚种，其形态、生理、代谢、生态和遗传等方面特征明显，现有数量约2 500只.以往对太行山猕猴的生态学研究主要集中在地理分布、种群数量调查等方面[4-6]，有关其种群遗传多样性研究尚无系统报道.作者利用mtDNA的特点，从分子生态学角度探讨生物多样性的保护问题，可为查清太行山猕猴的遗传背景、珍稀濒危物种的保护提供基础资料.

1 材料与方法

1.1样品采集

太行山猕猴为国家重点保护野生动物，因此，样品采集的原则是：1)以非损伤性取样为主，即仅采集太行山猕猴的粪便样品，尽量避免破坏性取样；2)各个样品应具有充分代表性，样品应来自该地区的不同地理种群，并尽可能使采样点散布于整个地区.为避免粪便样品中动物DNA的降解，采集到的新鲜粪样均用无水乙醇浸泡法并置冰箱-20 ℃保存.样品采集信息见表1.

表1 太行山猕猴粪便样品采集信息表

1.2方法

采用QIAGEN公司出品的粪便DNA提取试剂盒提取总DNA.PCR引物为GH：5′-AACTGGCATTCTATTTAAACTAC-3′；GL：5′-ATTGATTTCACGGAGGATGGT-3′.PCR反应体系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL；dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μL；Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL；BSA(10 mg/mL) 3 μL；Taq DNA酶(5 U/μL)(大连宝生物工程公司)0.5 μL；引物各1.25 μL；模板DNA 2.5 μL；纯水10 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性6 min，35个循环(94 ℃变性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s)，72 ℃再延伸6 min，4 ℃保存.PCR扩增产物利用试剂盒(大连宝生物工程公司)回收.回收产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司在全自动测序仪上完成单向测序反应.

1.3数据处理

用Clustal X[7]和MEGA 4.0[8]对测定序列进行比对.用DnaSP 4.5软件包[9]计算所获序列的单倍型多态性、核苷酸多态性及核苷酸差异均数和核甘酸歧异度.依据Nei的模型[10]，Hudson等[11]和Slatkin等[12]的计算方法，用Arlequin(version 3.0)软件包[13]分别计算地理单元之间的遗传分化系数(Gst)、迁移个体数(Nm)和遗传变异在种群内及种群间的分布Fst值，并用排列测验法检验Fst值的显著性(重复次数为1 000)，同时利用该软件包进行分子方差分析(AMOVA).以分布于中国广西的猕猴指名亚种(M.m.mulatta)(GenBank：AF135287.1)为外群，用MEGA 4.0构建个体系统树[8].

2 结果与分析

2.1变异位点的分析

用MEGA 4.0软件分析mtDNA控制区片段序列变异位点后发现，在所分析的22个猕猴个体的序列中，共检测到9种单倍型，11个变异位点，并且主要集中在序列的1～305个位点，分别位于第1，6，55，83，128，162，228，255，264，266和305位点(表2).11个变异位点中有9个位点是碱基转换，2个位点是颠换.

2.2群体遗传结构分析

不同地理种群中单倍型的分布见表3.在5个采样地区的种群中，共发现9种单倍型，其中王屋山种群的5个个体中，有4个个体共享一种单倍型；黄楝树种群的4个个体分属于三种单倍型，其中两个个体与王屋山种群的4个个体共享一种单倍型；五龙口种群的4个个体分属于两种单倍型；焦作沁阳种群的5个个体共享一种单倍型；新乡辉县种群的4个个体分属于两种单倍型，有3个个体共享一种单倍型.

表2 太行山猕猴D-loop片段9种单倍型的变异位点分布

表3 太行山猕猴9种单倍型在不同群体中的分布

2.3系统树分析

通过MEGA 4.0软件分析，并依据Kimma 2-Parameter模型，采用Bootstrap 1000检验分子系统树各分支的置信度[8]，构建太行山猕猴总群体和5个地区种群间的UPGMA(unweighted pair group method of arithmetic means)分子系统树(图1，图2).

Guangxi：广西猕猴，作为外群

Wang：济源王屋山；Huang：济源黄楝树；Wu：济源五龙口；Jiao：焦作沁阳；Xin：新乡辉县

由图1可见，各单倍型形成了以地理单元为特点的族群地理分布格局.由图2可见，王屋山种群和黄楝树种群聚在一起，五龙口种群和焦作沁阳种群聚在一起，新乡辉县种群独立成一支.因此将王屋山和黄楝树地区作为一个地理单元，命名为济源单元；五龙口和沁阳地区作为一个单元，命名为焦作单元；新乡辉县为一个独立单元，命名为新乡单元.

表4 遗传变异在地理单元中的分布

2.4分子遗传变异分析

分子方差分析(AMOVA)结果表明(表4)，显著差异主要存在于太行山猕猴不同的地理单元之间(ΦCT=0.880 21，P<0.001)和不同的种群之间(ΦST=0.889 71，P<0.00l).但是，同一地理单元内不同种群之间则不存在显著性差异(ΦSC=0.079 26，P=0.107).

2.5不同群体之间的遗传多样性分析

利用DnaSP 4.5软件，分别对5个地区的太行山猕猴种群遗传多样性参数进行计算分析(表5).结果表明，单倍型多样性(H)，核苷酸多样性(Pi)和平均核苷酸差异数(k)在济源黄楝树种群的数值明显高于其他4个地区，分别为0.833，0.002 93和1.000.在上述分析的基础上，对中性进化假说进行检验，发现太行山猕猴5个地区种群的Tajima的D值和Fu and Li的D值均不存在显著性差异(P>0.1)，符合中性突变，表明这些地区的太行山猕猴具有非常稳定的种群结构[14].

表5 太行山猕猴mtDNA多样性信息表(种群内)

2.6地理单元之间的遗传多样性

通过DnaSP 4.5分析软件，分别对济源(王屋山和黄楝树)、焦作(五龙口和沁阳)和新乡(辉县)三个地理单元之间进行比较(表6).结果表明，焦作-新乡地理单元间的核苷酸歧异度(Dxy=0.021 59)和平均核苷酸差异数(k=3.615 38)高于济源-新乡地理单元间的核苷酸歧异度(Dxy=0.019 31)和平均核苷酸差异数(k=3.461 54)及济源-焦作地理单元间的核苷酸歧异度(Dxy=0.010 46)和平均核苷酸差异数(k=2.176 47).

由表6可知，太行山猕猴在济源与焦作单元间的Fst值为0.828 72，两单元间每代迁移个体数为0.05；济源与新乡单元间的Fst值为0.898 73，两单元间每代迁移个体数为0.03；焦作与新乡单元间的Fst值为0.939 62，两单元间每代迁移个体数为0.02.济源与焦作单元间的Gst值为0.735 74；济源与新乡单元间的Gst值为0.803 40；焦作与新乡单元间的Gst值为0.893 72.可见三个地理单元间基因流和遗传分化系数的差异值均较高，地理单元间的每代迁移个体数几乎为零，表明太行山猕猴三个地理单元之间的遗传分化程度较高，基本不存在有效的基因交流，尤以焦作和新乡两单元之间最为明显.

表6 太行山猕猴mtDNA多样性信息表(地理单元之间)

3 讨论

3.1单倍型和群体的遗传结构分化

对太行山猕猴mtDNA控制区序列的比对结果表明，22个个体样品中存在9种单倍型.太行山猕猴群体的核苷酸多态性(0.010 64)低于川金丝猴群体(0.033)，大熊猫群体(0.06)[15]和白头叶猴群体(0.011 67)[16]的核苷酸多态性.从所检测的5个不同种群的单倍型多态性(H)和核苷酸多态性(Pi)来看，太行山猕猴不同地区的种群均存在高H值而低Pi值的特点(表5)，其群体的单倍型多态性(H)和核苷酸多态性(Pi)分别为0.827和0.010 64.这种高H、低Pi值的现象表明，整个太行山猕猴地理群体可能正在经历一个较小种群迅速扩增的过程.此外，在22只太行山猕猴个体中检出了9种单倍型，这一比例表明太行山猕猴不同个体间可能存在着广泛的遗传突变.在所得到的9种单倍型中，三个地理单元之间不存在相同的单倍型.但单倍型Wa2为济源地理单元内的王屋山群和黄楝树群所共享，即王屋山种群和黄楝树种群之间分化不显著.由此可知，太行山猕猴不同地理单元之间存在着明显的分化，而同一地理单元内不同种群之间的分化程度则要低一些；分子方差分析结果也支持这一结论[13].

分子方差分析结果表明，太行山猕猴不同地理种群的遗传差异主要由两部分组成，即不同地理单元之间(88.02%)和不同种群之间的差异(11.03%)，占全部遗传差异的99.05%(P<0.001)；而同一地理单元内不同种群间的遗传差异仅占总遗传差异的0.95%，且差异未达显著性水平(P=0.107).产生上述显著性差异的原因可能是猕猴栖息地之间的隔离，这种隔离使个体之间很难进行有效的基因交流从而产生明显遗传分化.但是，随着人口增长和经济的发展，人类与猕猴争夺生存空间的矛盾越来越突出，如开矿、砍伐林木、开荒种地、修建各种基础设施(铁路、公路、水库等)等活动给猕猴的栖息地环境造成了严重的破坏.栖息地的破碎化导致了不同地理单元之间缺乏有效的基因交流，从而产生了显著的遗传差异[17].

3.2分子系统地理学分析

从UPGMA法构建的聚类树(图2)可见，黄楝树种群和王屋山种群聚为济源地理单元，五龙口种群和沁阳种群聚为焦作单元，辉县种群独立成为新乡单元.由此可知，自然环境加上人类频繁活动的影响，导致猕猴栖息地的破碎化，逐渐发生隔离，最终形成相互独立的地理单元.太行山猕猴9种单倍型的系统发育关系树表明(图1)，各单倍型在系统树中并非杂乱分布，而是形成明显的按照地理单元为特点的分布格局(地理族群).造成9种单倍型的分布格局以及三个地理单元种群之间存在显著性遗传差异的主要原因，并不是原始自然地理环境的变迁，而在于人类的频繁活动、人类居住地的不断扩张以及人类活动对自然地理环境的改变.另外，单倍型Wa2、Wa4、H2、H4首先与其他单倍型产生分化，组成了单独的一支.济源地理单元中的黄楝树种群和王屋山种群共享一种单倍型，且单倍型在系统树中交叉分布，表明不存在依照不同群体聚集在一起的现象.据此推测，济源地理单元种群是三个地理单元种群中最古老的一个，而其余两个地理单元种群则形成较晚，或者可能是由济源单元种群迁移后分化而来.

3.3太行山猕猴的遗传多样性

遗传多样性是物种进化的内在动力，遗传变异程度的高低直接影响着物种进化速度的快慢.研究中对三个地理单元内5个群体的22个太行山猕猴个体的mtDNA 控制区片段HVI区域进行分析，Pi为0.010 64，表明太行山猕猴的遗传多样性程度较低.

影响遗传多样性的主要因素是在济源单元(王屋山和黄楝树)、焦作单元(五龙口和沁阳神农山)和新乡单元(辉县八里沟和关山)间，太行山猕猴的栖息地被人为或自然地分成隔离区域，分布呈现严重的片段化趋势.种群间相距最近的有15 km，最远达140 km，猴群之间可能难以进行有效的基因交流.因此，太行山猕猴种群的大小与其自身的生活史、遗传进化程度、栖息地质量以及人类活动等诸多方面均有关，在物种保护时应综合考虑，制定科学合理的保护规划和实施计划.

本研究发现，太行山猕猴种群的遗传多样性程度很低，地理单元之间的遗传差异有的低(如济源与焦作单元)、有的高(如济源与新乡以及焦作与新乡单元)，地理单元之间缺乏有效的基因交流，而且到目前为止并没有直接的证据表明各地理单元之间存在任何形式的基因交流.由彼此隔离的多个较小种群组成的太行山猕猴群体存在着因近亲繁殖而走向基因衰退，甚至物种灭绝的危险.建议自然保护区加大管理力度，建立生态走廊，促进各地理单元之间的有效基因交流，以保护太行山猕猴的遗传多样性水平、提高其适应能力.

总之，对单倍型地理分布情况和地理单元之间遗传差异水平的研究结果表明，太行山猕猴的遗传变异主要存在于地理单元之间，而同一地理单元内各种群之间的遗传变异并不显著，因此应对其分别进行保护[18-19].应在各地理单元之间和各种群之间建立“生态走廊”，为太行山猕猴提供更加适宜的生存环境，促进各群体间基因的有效交流，使物种遗传多样性得以保护.本研究初步分析了太行山猕猴遗传多样性及其空间分布，为太行山猕猴进化显著单元(evolutionarily significant units，ESUs)[20-21]和管理单元[21]的确定提供了依据.有关太行山猕猴与猕猴其他群体遗传多样性的比较尚待进一步探讨.

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MtDNA-basedPopulationGeneticDiversityofRhesusMacaquesinMt.TaihangshanArea,Henan,China

XIE Dong-ming1, LU Ji-qi1, WANG Jian-dong2

(1.InstituteofBiodiversityandEcology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001，China；2.AdministrationofTaihangshanMacaqueNationalNatureReserve,Jiyuan454650，China)

From November 2007 to February 2008,mtDNA-based population genetic diversity of rhesus macaques (Macacamulattatcheliensis) was investigated. Fecal samples were collected 5 separated groups among of 3 geographical units in Taihangshan Macaque National Nature Reserve (TMNNR) (35°11′N,112°16′E) in Henan,China. Total 22 mtDNA were extracted and used for genetic diversity analysis among different populations. The results showed that: ①the length of D-loop of mtDNA genome within 22 samples was 341 bp. Total 11 mutation sites,9 of transition and 2 of transversion,were identified among 22 samples;②there 9 haplotypes were found from 22 sequences within 3 geographical units;③the results from AMOVA indicated that 88.02% and 11.03% of the genetic variation happened among groups and within populations,respectively,while there 0.95% of the genetic variations occurred within groups. There were significant genetic differentiation,while no shared haplotypes being found,among Jiyuan,Jiaozuo and Xinxiang geographic units (P<0.01);and ④among the tested groups,Huanglianshu group in Jiyuan exhibited the highest haplotype number (3),the most haplotype diversity (0.833),the most nucleotide diversity (0.002 93) and the most average number of nucleotide differences (1.000). The results implied that Huanglianshu group should be protected with priority in the point of genetic diversity.

rhesus macaques (Macacamulatta);mtDNA;genetic diversity;Mt. Taihangshan

Q 16

A

1671-6841(2011)04-0089-07

2011-01-29

国家自然科学基金资助项目，编号30770381；郑州大学引进人才科研基金资助项目.

谢东明(1983- )，男，硕士研究生，主要从事保护生物学研究；通讯作者：路纪琪(1964-)，男，教授，博士，主要从事动物生态学研究，E-mail:lujq@zzu.edu.cn.