OVA-CdTe/ZnSe核壳量子点探针的制备及其应用

2012-01-09 02:03倪斌胡华军
中国医药导报 2011年33期

倪斌 胡华军

[摘要] 目的:制备CdTe/ZnSe核壳量子点标记卵清白蛋白(OVA)探针OVA-CdTe/ZnSe,并检测其特异性荧光示踪作用。方法:将CdTe/ZnSe核壳量子点与OVA偶联制备荧光探针,通过凝胶电泳和光谱分析鉴定偶联效果;然后示踪OVA致敏的小鼠外周血嗜碱粒细胞(BASO)表面IgE高亲和力受体FcεRI。结果:偶联OVA后的量子点分子量增加,荧光增强且荧光峰位从628 nm红移至635 nm。通过激光共聚焦显微镜能清晰观测到OVA-CdTe/ZnSe探针对BASO表面IgE-FcεRI复合物的荧光标记。结论:OVA-CdTe/ZnSe探针能示踪OVA特异性IgE-FcεRI复合物,此探针在OVA致敏动物模型的特异性IgE检测中具有一定应用价值。

[关键词] CdTe/ZnSe核壳量子点;免疫荧光标记;鸡卵清白蛋白;IgE

[中图分类号] R392-3[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2011)11(c)-019-03

Preparation and fluorescence-imaging application of OVA-CdTe/ZnSe core/shell quantum dots

NI Bin, HU Huajun*

Department of Pharmacy, College of Life Science, China Jiliang University, Zhejiang Province, Hangzhou310018, China

[Abstract] Objective: To establish a method to detect the IgE-FcεRI on BASO cells by using CdTe/ZnSe core/shell quantum dots(QDs) immuno-fluorescence labeling technology. Methods: CdTe/ZnSe core/shell QDs were coupled to the OVA with N-hydroxysuccinimide (NHS). After confirmation by agarosegel electrophoresis method and spectra analysis, the coupled product (OVA-CdTe/Znse) was used to detect the IgE-FcεRI on BASO cells. Results: Spectra analysis showed that the fluorescence intensity of OVA-CdTe/Znse was enhanced and the emission peak underwent a red-shift from 628 nm to 635 nm. Confocal fluorescence microscopy further showed that OVA-IgE-FcεRI on BASO cells characterized by the red fluorescence. Conclusion: OVA-CdTe/Znse fluorescence probes can effectively recognize IgE-FcεRI on BASO cells, which can be used in allergic animal model for detecting OVA specific IgE.

[Key words] CdTe/ZnSe core/shell quantum dots; Immuno-fluorescence labeling; OVA; IgE

支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)属于过敏性疾病的一种,其发病机制复杂,目前全球约有3亿哮喘患者,被WHO列为四大顽症之一。鉴于人体试验的局限性,对哮喘的干预研究往往通过建立与人相似症状的动物模型来进行。常用的哮喘动物(大鼠、小鼠、豚鼠)模型都存在不足之处。如豚鼠致敏后的变态反应与人类的不同,其更多由IgG介导;大鼠、小鼠制作的哮喘模型能产生特异性IgE,可临床指征不明显[1]。因此有必要寻找和开发新的哮喘动物模型。但哮喘新模型的开发还面临一个具体问题,即除大鼠、小鼠、豚鼠外的其他实验动物在卵清白蛋白(OVA)致敏后,因缺乏血清OVA特异性IgE的检测试剂,使致敏效果难以判断,这也阻碍了新模型的开发[2]。根据外周血嗜碱粒细胞(BASO)表面的IgE高亲和力受体FcεRI的密度与血清IgE水平有较好的相关性[3]。可研制一种OVA荧光探针,用于对OVA致敏动物的外周血BASO细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI进行荧光标记,通过其荧光示踪可知该动物的致敏效果。量子点(quantum dots,QDs)荧光标记技术是近些年发展起来的一项新型荧光示踪技术。本研究利用巯基丁二酸为表面修饰剂合成的水溶性CdTe/ZnSe核壳QDs与OVA偶联,制备OVA-CdTe/ZnSe探针,用于对OVA致敏的小鼠外周血BASO细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI进行荧光标记。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

巯基丁二酸(Mercaptosuccinic acid,MSA)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)和佐剂液态铝(Sigma-Aldrich公司);碲粉(Te)、硒粉(Se)、氯化镉(CdCl2)、硼氢化钠(NaBH4)、氧化锌(ZnO)(中国医药集团上海化学试剂公司);C57BL/6小鼠(6~8周龄雄性,购自浙江大学实验动物中心);去离子超纯水处理系统(Milli-Q,Millipore公司);凝胶成像系统(购自Gene Genius);紫外-可见分光光度计(UV-2550,Shimadzu公司);荧光光谱仪(F-2500,Hitachi公司);激光共聚焦显微镜(Leica TCS-SP,Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 OVA-CdTe/ZnSe探针的制备MSA包覆的CdTe/ZnSe核壳QDs的制备方法见参考文献[4-5]。将CdTe/ZnSe与OVA进行共价连接,即首先用NHS将QDs表面配体的羧基活化,然后再与蛋白质表面氨基反应形成酰胺键,即得CdTe/ZnSe与OVA的偶联物。具体方法:在1 ml水(NaOH调pH=8)中,加入200 μl巯基丁二酸修饰的CdTe/ZnSe溶液(OD488值为0.25)和50 μl 0.2g/L NHS,室温活化10 min后,再加入100 μl OVA (0.1 mg/ml),室温条件下旋转混匀30 min,然后将CdTe/ZnSe与OVA偶联产物进行离心纯化即得OVA-CdTe/ZnSe探针,4℃保存备用,使用时以水溶解。

1.2.2 OVA-CdTe/ZnSe探针的凝胶电泳和光谱检测琼脂糖凝胶电泳分析CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的分子大小变化,其电泳条件:琼脂糖凝胶浓度0.8%,电压80 V,电泳时间15 min,采用凝胶成像系统成像分析。UV-2550紫外-可见分光光度计测量CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的吸收光谱变化,以水(pH=8)作空白校正基线。F-2500荧光光谱仪测量CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的荧光发射光谱的变化,激发波长为460 nm,以水调零。

1.2.3 OVA-CdTe/ZnSe探针标记嗜碱粒细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI 分别于第0、14天对C57BL/6小鼠腹腔注射致敏液0.2 ml(0.08%的OVA 0.1 ml与等体积佐剂液态铝混合)致敏;第15天眼球采血,Percoll密度梯度离心法分离外周血BASO细胞。将BASO细胞于含有0.3%Triton-100的PBS作用10 min,0.01 mol/L PBS洗3次;于含有10%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中封闭20 min。滴加OVA-CdTe/ZnSe探针(用含10%BSA的PBS稀释,对照滴加BSA-CdTe/ZnSe和CdTe/ZnSe),置于湿盒中,37℃,30 min。先0.01 mol/L PBST洗3次,然后0.01 mol/L PBS洗3次;缓冲甘油封片。在激光共聚焦显微镜下成像,激发波长为488 nm。

2 结果

2.1 CdTe/ZnSe与OVA偶联效果的鉴定

CdTe/ZnSe及其与OVA偶联物的表面带有大量的羧基负电荷,在电场中会向正极泳动。图1为CdTe/ZnSe与OVA偶联物的电泳结果。如图2所示,在400~700 nm范围内,CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的吸收光谱随波长变化不明显,而偶联后的荧光略有增强,且荧光峰位从628 nm红移至635 nm。

2.2 OVA-CdTe/ZnSe探针荧光示踪OVA特异性IgE-FcεRI复合物

在激光共聚焦显微镜视野下,能清晰观测BASO表面IgE-FcεRI复合物被OVA-CdTe/ZnSe探针标记后发出的红色荧光(图3-A),而BSA-CdTe/ZnSe和CdTe/ZnSe因不能与细胞膜结合而无明显荧光(图3-B、3-C)。

3 讨论

QDs是一种由Ⅱ~Ⅵ族或Ⅲ~Ⅴ族元素组成的尺寸在1~100 nm之间稳定的微小晶粒,受激后可以发射荧光[6]。QDs的激发波长范围可以涵盖整个光谱,用同一波长的光可以激发不同的QDs,同时获得多种颜色荧光,方便用于多目标分子的多色标记,并且核壳结构QDs的表面经过修饰,其毒性要比有机荧光染料弱得多,很有希望成为新一代生物荧光标记物[7]。本研究合成的CdTe/ZnSe核壳QDs不需经过任何后续处理,荧光产率高达44%,并且ZnSe外壳及MSA的修饰大大提高了原始CdTe核的稳定性和生物相容性[4-5]。将CdTe/ZnSe与OVA共价连接后,复合物粒径和相对质量增大,因此导致电泳迁移率降低。同时与CdTe/ZnSe的电泳条带相比,CdTe/ZnSe与OVA偶联物的荧光条带展宽,是由于QDs与蛋白的偶联比不固定所致。CdTe/ZnSe与OVA偶联后会对CdTe/ZnSe的荧光性质产生一定的影响,其原因可能由于蛋白质对量子点的表面修饰,而且量子点经NHS作用与蛋白质经过共价连接,一个蛋白可能结合多个量子点,拉近量子点之间距离,导致量子点之间的偶极相互作用增强,使其Stokes位移增大,荧光峰位红移[8-9]。这些都表明CdTe/ZnSe与OVA偶联成功,经纯化后即获得OVA-CdTe/ZnSe探针。另外本研究采用Percoll密度梯度离心法分离OVA致敏小鼠的外周血BASO细胞,致敏小鼠所产生的OVA特异性IgE可与BASO细胞表面FcεRI结合,形成FcεRI-IgE复合物,而OVA又能与OVA特异性IgE结合,经OVA-CdTe/ZnSe探针标记后即可在BASO细胞表面形成了FcεRI-IgE-OVA-CdTe/ZnSe复合物,通过荧光成像可清晰显示出BASO细胞表面FcεRI的密度。由于OVA-CdTe/ZnSe探针识别OVA特异性IgE介导连接FcεRI,因此应用上不受物种限制,尤其在开发哮喘新动物模型的特异性IgE检测方面具有很好的应用价值。

[参考文献]

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(收稿日期:2011-10-24)

[基金项目] 浙江省实验动物科技计划项目(编号:2009F80011)。