一种真菌漆酶的克隆与序列分析

马文寅， 蔡宇杰＊， 廖祥儒， 胡 艳， 李枝玲， 张大兵

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏 淮安 223001）

一种真菌漆酶的克隆与序列分析

马文寅1， 蔡宇杰＊1， 廖祥儒1， 胡 艳1， 李枝玲2， 张大兵2

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏 淮安 223001）

比较了几种不同真菌DNA提取方法对血红密孔菌基因组的提取的影响，根据GenBank中真菌漆酶氨基酸保守序列设计的简并引物，以血红密孔菌基因组总DNA为模板，扩增到一条长度为1084 bp的DNA片段。通过BLAST比对，其基因序列与密孔菌属同源性最高，为99%，氨基酸同源性为88%，说明扩增的片段确为密孔菌漆酶基因。

漆酶；克隆；序列分析；血红密孔菌

漆酶（Laccase，EC 1 1.0.3.2）是一种多酚氧化酶，最早是从漆树中发现的［1］。漆酶广泛存在于真菌以及植物中，某些昆虫、细菌也能够分泌漆酶［2］，主要包括漆树漆酶（rhus lactase）和真菌漆酶（fungal lactase）两大类。漆酶可以氧化降解多酚类化合物及其衍生物，具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力［3］，且作用范围较广。因此，它们在生物制浆，生物漂白，芳香化合物脱毒，环境垃圾处理等［4］，以及生漆的干燥成膜和毛发染色、纸浆生产中木质素的降解、生物传感器、酶法免疫分析、有机合成、土壤修复等领域具有广泛的应用前景［5］。白腐菌是真菌中漆酶主要的生产者［6］，但培养的过程中周期较长，在培养过程中容易被污染，不利于工业化生产［7］。而且随着环境越来越受到人们的重视，漆酶的研究也越来越受到人们的关注。目前国内对漆酶分子水平的研究还处于初步阶段，许多生理机制还不能够从分子水平对其进行合理的分析，因此，对漆酶在基因水平的研究也显得越来越重要。作者采用基因扩增的方法，从血红密孔菌基因组中成功克隆出漆酶的基因片段，对其进行了序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株血红密孔菌，PycnoporussanguineusSYBC－L1，作者所在实验室保存。

1.1.2 试剂Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒：购自南京博飞科技有限公司；Taq DNA聚合酶、d NTP Mixture、Buffer、marker、PCR 产物纯化试剂盒：均购自宝生物（大连）有限公司；引物：南京金斯瑞生物有限公司合成；琼脂糖：进口分析纯；其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 仪器超净工作台（SW－CJ－1FD）：杭州齐威仪器有限公司产品；回转式恒温摇床（HZC－250）：杰瑞尔电子有限公司产品；恒温培养箱（LHS－250 HC）：江苏州江东精密仪器有限公司产品，基因扩增仪（TC－96／G／H（b）A）：杭州博日科技有限公司产品，电泳仪，凝胶成像系统。

1.2 培养基及培养条件

发酵培养基（g／L）：土豆200，葡萄糖20，愈创木酚1 m L。121℃灭菌，p H值自然。

菌丝收集：将菌种接种到250 m L摇瓶，装液量50 m L，30℃培养48 h。用质量分数0.9%的生理盐水洗涤数次，直至洗涤液呈无色，离心尽量除去上清液，收集菌体，－20℃保存。

1.3 基因组提取方法

分别采用CTAB法、植物提取方法、基因组试剂盒的方法提取基因组DNA。

1.3.1 CTAB法参照 Guo等［8］的方法。取0.2 g收集的菌体，加入液氮研磨至粉末，迅速转入1.5 m L的离心管中，并加入裂解液（质量分数2%CTAB），65 ℃水浴45 min，13 000 r／min离心10 min；取上清于一新的离心管中，加等体积的混合溶液V（氯仿）∶V（异戊醇）＝24∶1，12 000 r／min离心10 min；取上清，加2倍体积的无水乙醇和2 mol／L的NaCl溶液，－20℃沉淀30 min，12 000 r／min离心20 min；收集沉淀，体积分数75%乙醇溶液冲洗，洗涤时注意切勿将沉淀倒出，在超净工作台中真空干燥；加入100μL TE缓冲液溶解DNA，－20℃保存备用。

1.3.2 植物基因组提取方法质量分数2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；取少量菌体置于研钵中，液氮研磨至粉末转移至离心管中；加入700μL的质量分数2%CTAB抽提缓冲液，轻轻摇匀；置于65℃水浴锅中保温，每隔10 min轻轻摇动几下，使混合均匀，30 min后取出；冷却2 min后加入等体积的V

（氯仿）∶V（异戊醇）＝24∶1，振荡2～3 min，使两者混合均匀；10 000 r／min离心10 min，与此同时，将600μL的异丙醇加入另一个新的离心管中；10 000 r／min离心1min后，将上清液转入含有异丙醇的离心管中，上下摇动30 s，使之充分混合；10 000 r／min离心1min后，倒掉上清，注意勿将沉淀倒出；加入800μL体积分数75%的乙醇溶液洗涤沉淀；加入50μL TE缓冲液，溶解DNA；置于－20℃保存备用［9］。

1.3.3 试剂盒提取方法参照试剂盒说明书进行操作。取不多于50 g悬浮培养的细胞，离心去除上清，液氮研磨，放入1.5 m L的离心管中（注意：样本的磨碎程度将影响裂解效果）；加400μL LE Buffer，并混合均匀，混合充分有助于裂解（可选：加入4 μL的100 mg／m L RNase A）；与65℃环境中温浴15～30 min（温浴过程中可间或振荡离心管2－3次），然后移除（对于难裂解的样本可适当延长温浴时间）；加入130μL DA Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5 min；于14 000 r／min离心3 min；将上清液转移到一个新的1.5 m L离心管；加入750μL或滤液体积1.5倍的E Binding Buffer，并混合均匀；将混合液体转移至Spin column；于6 000 r／min离心1 min，并弃去接液管中的液体；由于混合液体体积大于750μL，分两次离心过柱；向Spin column中加入500μL的G Binding Buffer；于10 000 r／min离心30 s，弃去接液管中液体；Spin column中加入600μL的 Wash Buffer；于10 000 r／min离心30 s，并弃去接液管中液体；上一步骤重复一次；再次将Spin column于10 000 r／min离心1 min，并将Spin column转移至一个新的1.5 m L离心管；向Spin column中加入100μL至200μL Elution Buffer，并于室温温浴1 min；于12 000 r／min离心1 min，并弃去Spin column；1.5 m L离心管液体含有DNA；于－20℃保存。

1.4 PCR扩增

1.4.1 引物设计 根据GenBank中漆酶的保守氨基酸序列，采用blastp比对其同源性，通过Primer Premier 5和Oligo 7.0软件设计一对简并引物，上游引物：ATGTCCAGATTCC AATCTCTCC；下游引物：GAGATCGCTGGGGTCCAAGTG。

1.4.2 PCR扩增以血红密孔菌基因组总DNA为模板，进行PCR的扩增。反应体系20μL，包括：PCR Buffer 2μL；Mg2＋1.5μL；d NTPs 2.5μL；上下游引物各1μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；DNA模板3μL；加入dd H2O至20μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，34个循环之后72℃充分延伸10 min。扩增反应结束后，产物经体积分数1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.3 进化树的构建利 用 Clustalx2.0结合MEGA5.0，构建PycnoporussanguineusSYBC－L1的系统发育树。首先将扩增得到的漆酶基因序列通 过 BLAST （http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）寻找相似序列以进行同源分析。采用Clustalx2.0对在NCBI查找的具有同源性的漆酶基因序列进行多序列比对，用UltraEdit进行序列调整，采用软件 Mega5.0用邻位相连法（neighborjoining，NJ）构建（Kimura 2－parameter distance calculation）进化树。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

用3种方法进行DNA的提取，每个样品使用移液枪吸取2μL进行凝胶电泳检测（电压80 V，时间40 min），配制体积分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测其结果，结果如图1所示。从图中可以看出，几种基因组提取的方法对DNA的提取效果并无明显的区别，提取的DNA模板完全可以满足基因扩增的要求。采用试剂盒的方法提取，与其他方法相比，时间较短，能够迅速地提取出DNA模板，进入下一步实验；CTAB法是由于真菌细胞结构与植物相似而借鉴的植物提取法，因此两者提取方法大同小异。无论采用哪种方法，对于菌体的处理都是首要的，首先要研磨充分，且要在研磨充分时及时加入裂解液，使得释放的DNA及时溶解在裂解液中，而不会遭到破坏［10］。

如果需要提取较高纯度的模板，可以对以上几种方法再进行改良加工，加入RNase A，可以较好地除去RNA杂质。在提取或者纯化的过程中，如在液氮研磨时，若操作较剧烈，易导致DNA的断裂，因此要注意操作的温和性。

2.2 基因片段的扩增

采用简并引物扩增的基因片段，用体积分数1%的凝胶电泳检测得到两条片段，利用凝胶成像系统观察结果，如图2。将条带进行切胶回收，经测序，得到长度为1 084 bp的基因序列。将测序所得到的基因序列在NCBI上利用blastn进行基因序列比对，发现该基因序列与密孔菌属的Pycnoporuscoccineus和Pycnoporussanguineus均有较高的同源性，相似度最大达到99%，说明扩增得到的基因片段为密孔菌漆酶的基因序。

图1 基因组DNAFig.1 Genomic DNA

图2 简并引物扩增基因片段Fig.2 Laccase gene fragment amplified

2.3 基因序列分析

经DNAMAN软件分析，扩增的基因片段含有1 084个碱基，编码360个氨基酸。利用NCBI上的blastx比对分析，扩增出的基因片段编码的氨基酸序列与Pycnoporuscoccineus相似，同源性达到88%，与碱基序列比对结果一致。

表1 扩增漆酶基因片段与其他真菌漆酶基因同源性比较Tab.1 Homology alignment of the amplified fragment and other fungi laccase genes

表2 扩增漆酶基因片段与其他真菌漆酶氨基酸序列同源性比较Tab.2 Homology alignment of the amplified fragment and the amino acid sequences of other fungi laccase genes

图3 14种不同来源漆酶氨基酸序列比对Fig.3 Homology alignment of the fourteen amino acid sequences

图4 来源于Pycnoxcporus sanguineus漆酶的氨基酸序列比对Fig.4 Alignment of amino acid sequence of laccase from Pycnoporus sanguineus

图5 来源于Pycnoporus coccineus漆酶的氨基酸序列比对Fig.5 Alignment of amino acid sequence of laccase from Pycnoporus coccineus

图6 来源于Pycnoporus cinnabarinus漆酶的氨基酸序列比对Fig.6 Alignment of amino acid sequence of laccases from Pycnoporus cinnabarinus

漆酶一般含有4个铜离子，分别结合在3个高度保守的结合区域。根据光谱学特性，漆酶所包含的4个铜离子可以分为3类：Ⅰ类和Ⅱ类铜离子各一个，Ⅲ类铜离子两个。漆酶的来源不同，蛋白质也有很大差异，甚至来源相同的漆酶相对分子质量也会不同，但是结合铜离子的区域的同源性却很高，即铜原子连接的1个Cys和10个His及其周围的氨基酸残基都是很保守的。这些氨基酸都分布在含有两对His的N末端区域，或是分布于C末端的Cys和其余结合铜离子的His之间［11］。

作者比对分析了14种漆酶的不同种属来源的漆酶氨基酸序列后发现，有3处较为保守的氨基酸序列，为漆酶的4个铜离子结合区域。其中－HWHG－是漆酶最为保守的氨基酸序列，不仅相同种属的这一序列同源性较高，且不同种属来源的漆酶也包含这一保守区域。这些保守的铜离子结合区域决定了酶的活性位点以及催化位点。

将克隆得到的密孔菌基因序列翻译成氨基酸序列后，与密孔菌属其他3种菌株作了序列比对，发现－LTNHTMLKTTS－、－HWHGLFTNWADG－、－NQCPIASGHSFLYDF－在密孔菌属的3种菌的氨基酸序列中还是比较保守的，推测这3处保守序列不仅与漆酶的蛋白质的正确折叠有关，还与密孔菌属特有的催化活性或者底物特异性有关。白腐菌产生的漆酶具有降解废水中含酚化合物、苯氧基类除草剂和石油工业废物等污染物的作用，可能与密孔菌属特异的保守序列有关。PycnoporussanguineusSYBC－L1的稳定性较好，不仅在p H 4.0～10.0的范围内能保持较高的活性，而且能够在高温和低温下仍具有较好的催化活性。有机溶剂是通过介入酶蛋白的活性中心来影响酶的催化活性，PycnoporussanguineusSYBC－L1对于有机溶剂的耐受性也比较好。PycnoporussanguineusSYBCL1稳定的酶学性质是由它的基因序列决定的。

2.4 系统进化树分析

采用软件 Mega 5.0用邻位相连法（neighborjoining，NJ）构建进化树如图7，可以看出，PycnoporussanguineusSYBC－L1在遗传距离上与Trametesversicolor比较相近，而与Sporidiobolus salmonicolor较远。

对漆酶进行克隆以及序列分析，最终的目的都是为了更好的实验基因的外源表达。而目前国内外对于漆酶的研究上都是在真菌方面。因此，表达载体一般就是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）［12－15］和甲醇毕赤酵母［7，16］两种，使得漆酶的异源表达研究面较窄。基于漆酶在生物降解，环境保护等方面的重要作用，实现漆酶的高效表达具有重要的价值和意义，所以进一步加强对于漆酶分子水平的研究，使得漆酶更好地运用在环保方面，能够充分实现它的价值。

图7 HJ法构建扩增漆酶基因系统进化树Fig.7 Neighbor－joining tree of the amplified sequence

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Cloning and Sequencing Analysis of a Laccase Gene from Fungus

MAWen－yin1，CAIYu－jie＊1，LIAOXiang－ru1，HUYan1，LIZHI－ling2，ZH ANGDa－bing2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Hanbon Science ＆Technology Co.Ltd，Huaian 223001，China）

Effect of several different methods on the DNA extraction fromPycnoporussanguineuswere compared in this study.Degenerate primers were designed according to the fungal laccase condervation sequences which was registered on GenBank，.A 1084bp laccase gene fragment was amplified by using genomic DNA fromPycnoporussanguineusas template.According to the BLAST results，we found that the sequence presented a very high match with the laccase gene fromPycnoporusand shared considerable homology of above 99%.The alignment of amino acids shared considerable homology of above 88%.Therefore，the genomic DNA should be Pycnoporus.

laccase，cloning，sequence analysis，Pycnoporussanguineus

Q 814

A

1673－1689（2012）01－040－07

2011－01－23

国家自然科学基金项目（21045007）；江苏省科技创新与成果转化（重大科技支撑与自主创新）专项引导资金项目（BY2010117）；科技部科技人员服务企业项目（2009GJ10038）。

＊

蔡宇杰（1973－），男，江苏无锡人，工学博士，副教授，主要从事生物分离技术研究。Email：yu＿jie＿cai＠yahoo.com.cn