几种酚酸对木聚糖酶活力的影响

田 野， 欧仕益

（暨南大学 食品科学与工程系，广东 广州 510632）

几种酚酸对木聚糖酶活力的影响

田 野， 欧仕益＊

（暨南大学 食品科学与工程系，广东 广州 510632）

采用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）测定酶解后还原糖释放量，研究4种不同酚酸（阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸、单宁酸）对木聚糖酶活力的影响。结果表明：阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸能提高木聚糖酶活力，当这3种酚酸质量浓度为0.75 mg／m L时，酶活力分别提高65.59%、46.21%和12.83%。单宁酸抑制木聚糖酶活性，添加量为0.50 mg／m L时，抑制率达37.18%。动力学研究表明：上述4种酚酸均能提高酶与底物的亲和力，对－香豆酸能提高酶反应速度，但单宁酸会使反应速度显著降低。

酚酸；木聚糖酶；酶活力

纤维质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，它是地球上最大的可再生资源［1］。利用纤维质降解发酵生产燃料乙醇是目前的热门课题［2，3］。目前制约纤维质生物酒精生产的主要障碍是酶解成本过高，约占总生产成本的40%～55%［4－6］。因此，提高酶解效率对于解决生物能源问题具有重要意义。

植物秸秆中含有质量分数0.4%～3.6%的酚酸，主要是阿魏酸和对－香豆酸，它们通常是通过酯键与低聚糖侧链上的糖残基相连［7－11］。Anderson和Akin研究发现：一些富含酯化阿魏酸、香豆酸但不含木质素的细胞很难酶解，如C4植物维管束鞘薄壁细胞［12］；而 Mussatto等人先用碱预处理啤酒大麦渣再用纤维素酶降解，发现葡萄糖和纤维二糖释放率增加4倍［13］。

这些研究表明，酚酸对纤维质降解的两种主要酶纤维素酶和木聚糖酶似乎影响较大，但直接研究酚酸对这两种酶的影响国内外尚未见报到。作者将4种不同质量分数的酚酸添加到木聚糖酶反应体系中，研究酚酸对木聚糖酶的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木聚糖：广州市齐云生物技术有限公司产品；木聚糖酶（2500FXU）：诺维信（中国）生物技术有限公司产品；阿魏酸（纯度：98%）：上海试剂一厂产品；对－香豆酸（SIGMA）：广州市齐云生物技术有限公司产品；单宁酸：天津市福晨化学试剂厂产品；水杨酸：天津市大茂化学试剂厂产品；其它所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SHA－B水浴恒温振荡器，江苏金坛市医疗仪器厂产品；HH－4恒温水浴锅，江苏金坛市宏华仪器厂产品；KDC－1044低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司产品；UV－9600紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司产品。

1.3 酚酸对酶活力的影响

1.3.1 酚酸对木聚糖酶活力的影响用0.1 mol／L醋酸－醋酸钠缓冲液（p H＝5.5）配制质量分数分别为0.50%的木聚糖液和0.20%的木聚糖酶液，分别配 制 0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的下列酚酸溶液：阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸、单宁酸。取100 m L三角瓶，各加入20 m L木聚糖液、10 m L木聚糖酶液和10 m L酚酸溶液，在55℃、转速100 r／min下，振荡培养3h后，放入沸水浴中灭活15 min终止反应。离心，取1 m L上清液用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖，各处理重复3次。

1.3.2 酚酸影响木聚糖酶活性的动力学研究

1）阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸影响木聚糖酶活性的动力学研究 用0.1 mol／L醋酸－醋酸钠缓冲液（p H＝5.5）配制质量分数为 0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%的木聚糖溶液及0.004%的木聚糖酶液。分别配制0.25%的下列酚酸溶液：阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸。取5支10 m L试管分别加入2 m L木聚糖酶液，在55℃水浴中孵育10 min后，再分别加入4 m L不同浓度的木聚糖液和2m L酚酸溶液，继续孵育5 min。立即置于沸水浴中灭活。离心，取2 m L上清液用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖，各处理重复3次。采用Lineweaver－Burk双倒数法制得酶动力学曲线并计算Km和Vmax值。

2）单宁酸影响木聚糖酶活性的动力学研究分别配制质量分数为0.25%的单宁酸和0.4%的木聚糖酶液（0.1 mol／L、p H＝5.5醋酸－醋酸钠缓冲液配制），按上述方法进行试验。采用Lineweaver－Burk双倒数法制得酶动力学曲线并计算Km和Vmax值。

1.4 统计分析

各组还原糖含量数据为3次平行测定值（平均值±标准误差）。用SPSS 13.0统计软件，单因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan检验，P≤0.05时为显著差异。

2 结果与分析

由表1可知，阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸均能提高木聚糖酶的活力。随着酚酸质量分数的增加，催化体系中的还原糖质量浓度也随之升高。当阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸的质量浓度达到0.75 mg／m L 时，促 进 率 分 别 为 65.59%、46.21% 和12.83%。

单宁酸会抑制木聚糖酶的活性，这种抑制作用在单宁酸质量浓度为0.50 mg／mL时达到最大，此时的抑制率为37.18%。当体系中单宁酸质量浓度超过0.50 mg／mL时，还原糖质量浓度会有所回升。

由表2和表3所示，与未加酚酸样相比，阿魏酸和水杨酸均表现为最大反应速度基本不变，而Km值明显减小；这表明阿魏酸和水杨酸能够增加木聚糖酶对底物的亲和力。而对－香豆酸的动力学结果表现为最大反应速度增大，Km值减小，其变化较小，表明对－香豆酸不仅能提高酶与底物的亲和力，还能作用于酶－底物复合物，使其分解速度增加并促进木糖的生成从而提高木聚糖酶活力。与上述3种酚酸相反，单宁酸对木聚糖酶的抑制作用，表现为最大反应速度和Km值均显著减小，这说明单宁酸既能作用于游离的木聚糖酶，提高其亲和力，又能与酶－底物复合物结合，降低酶反应速度，从而表现对木聚糖酶的抑制作用。

表1 不同酚酸对木聚糖酶释放还原糖的影响（n＝3）Tab.1 Effect of phenolic acids concentrations on the released o reduce sugars from xylanase（n＝3）

表2 阿魏酸、对香豆酸和水杨酸对木聚糖酶（10μg／mL）活性影响的动力学测定结果（n＝3）Tab.2 Effect of ferulic，coumaric and salicylic acid concentration on the kinetics activity of xylanase（n＝3）

表3 单宁酸对木聚糖酶（1 mg／m L）活性影响的动力学测定结果（n＝3）Tab.3 Effect of tannic acid on the kinetic activity of xylanase（n＝3）

目前，酚酸对木聚糖酶的影响国内外还未见报到。研究结果表明：添加阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸能提高木聚糖酶活性，说明碱预处理提高解纤维质的降解率主要是打断酚酸对纤维质的交联，但同时也可能因为释放出阿魏酸等酚酸而增加酶解效率，但3种酚酸影响木聚糖酶的作用机理还有待进一步研究。

单宁酸对酶促反应的抑制作用可能是多方面因素共同作用的结果：1）酶的化学本质是蛋白质，与一般的蛋白质一样，酶与单宁结合生成不溶性的结合物，该结合物较酶的构型有所改变，从而造成酶活力的降低或丧失；2）对于以生物大分子为底物的酶促反应，单宁酸也可同底物结合，剥夺酶的催化底物或生成能降低酶活性的化合物；3）金属离子，例如 Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋对某些酶起到了激活作用，有的还可作为酶的辅基，而单宁对金属离子具有络合作用，进而抑制酶活力［14］。

3 结语

阿魏酸、对－香豆酸、水杨酸能提高木聚糖酶的活力。这3种酚酸对木聚糖酶促进效果最大时的质量浓度均为0.75 mg／m L，此时的促进率分别为65.59%、46.21%和12.83%；其动力学研究表明：添加上述酚酸均可以提高酶与底物的亲和力，而且对－香豆酸还会增大酶反应速度。

单宁酸对木聚糖酶具有抑制作用，表现为既提高酶与底物的亲和力且显著降低酶反应速度。单宁酸对木聚糖酶的最大抑制质量浓度为0.50 mg／m L，最大抑制率为37.18%，超过最大抑制质量浓度，其抑制效果会有所降低。

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［14］石碧，狄莹.植物多酚［M］.北京：科学出版社，2000.

Influence of Phenolic Acids on Activity of Xylanase

TIANYe，OUShi－yi＊
（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

In this manuscript，effect of four phenolic acids，including ferulic，coumaric，salicylic and tannic acid，on the activity of xylanase was investigated through determination of reducing sugars releasing from xylans.The results showed that 0.75 mg／m L ferulic，coumaric and salicylic acid could increased the activity of xylanase by 65.59%，46.21%and 12.83%，respectively.However，tannic acid was found as inhibitor of xylanase，and the activity decreased 37.18%when 0.50 mg／m L was presented.The results of enzyme kinetics showed that these phenolic acids increased the affinity of xylanase for the substrate.The reaction speed increased with coumaric acid added，and significantly reduced by tannic aci

phenolic acid，xylanase，activity

Q 946.5

A

1673－1689（2012）01－096－05

2011－02－25

广东高校科技成果产业化重大项目（cgzhzd0709）。

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欧仕益（1963－），男，湖南长沙人，教授，主要从事食品化学及功能性食品研究。Email：tosy＠jnu.edu.cn