肿瘤干细胞蛋白质组学的研究进展

闵凌峰 徐兴祥 宋 勇

恶性肿瘤是严重危及人类生命健康的疾病，其病死率呈逐年上升的趋势［1］。我国恶性肿瘤死亡率处于世界较高水平，且随着生态环境、生活方式的改变而呈现持续性上升势头［2］。目前，对于多数恶性肿瘤可以采用手术、放化疗及生物免疫治疗等方法，但却无法从根本上治愈肿瘤。肿瘤干细胞概念的提出为治愈肿瘤提供了一线希望，也使得近些年来肿瘤干细胞领域的研究进入了高速增长期［3］。蛋白质组学(proteomics)是研究细胞内全部蛋白质的组成及其规律的学科，即指某一物种、个体、器官、组织或者细胞基因组的全部蛋白质产物的表达谱［4］。在过去的几十年中，蛋白质组学技术已在肿瘤研究中取得了丰硕的成果，这些研究反映在肿瘤的发生机制、转移及耐药的分子机制、以及预后和治疗反应的生物标志物等方面［5］。目前，将蛋白质组学技术应用到肿瘤干细胞研究中的报道还很少。现就肿瘤干细胞蛋白组学方面的研究进展进行综述。

一、肿瘤干细胞的概念与特性

美国癌症研究协会的干细胞研讨会(The American Association for Cancer Research Stem Cell Workshop)对于肿瘤干细胞的定义为:肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞性质的肿瘤干细胞，具有无限的自我更新能力，可以产生与上一代完全相同的子代细胞，并且具有多种分化潜能和高度增殖能力，可形成由异质性肿瘤细胞组成的肿瘤组织［6］。虽然肿瘤干细胞在肿瘤组织中的含量较少，在大部分病例中少于1%，但是其对肿瘤患者的预后有着重要的影响。

从功能的角度来看，肿瘤干细胞具有很多与正常干细胞相似的特性，包括:①具有相似的表面标志物及信号传导通路:如CD147、CD133、CD44、Sox2、ABCG2/BCRP1等表面标志物，存在相似的生长调控机制，如Notch、Wnt和Shh等信号通路［7-8］;②多处于细胞周期的静息期或休眠期，即长期处于细胞生长周期的G0期;③均具有自我更新和分裂增殖能力;④都具有多向分化的潜能;⑤均具有高表达的ABC转运蛋白水平及DNA修复水平，连同他们的低增殖指数，使这些细胞对放化疗均不敏感。但肿瘤干细胞又具有一些与正常干细胞不同的特性:①正常干细胞具有自我稳定调控能力不会无限制生长，而肿瘤干细胞缺乏自稳能力;②肿瘤干细胞缺乏分化成熟的能力，缺乏自我更新信号转导途径的负反馈调节机制;③肿瘤干细胞倾向于累积复制的错误，而正常成体干细胞能够防止复制错误的发展;④肿瘤干细胞对染料Hoechst 33342拒染［9］。

二、肿瘤干细胞蛋白质组学研究的意义

目前肿瘤干细胞研究中热点领域主要集中在以下几个方面，第一是肿瘤干细胞形成的分子机制上。目前在肿瘤形成的机制上主流有两派学说，一派为“基因突变”学说，他们认为肿瘤是正常细胞中基因突变不断累积，最后形成的肿瘤细胞;另一派就是“肿瘤干细胞形成”学说，认为先由正常干细胞或其他细胞形成肿瘤干细胞，再由肿瘤干细胞逐步分化出肿瘤细胞。但是，目前肿瘤干细胞形成的分子机制还不清楚，有研究发现干细胞两个重要的调节基因WNT-1基因及WIF-1与肺癌的发生发展有着重要的联系。但正常干细胞是如何形成肿瘤干细胞的，在这个过程中，那些基因的表达受到了调控，起到了怎样的作用，这些都不清楚。因此，检测肿瘤干细胞与正常细胞及正常干细胞之间的差异表达基因具有很重要作用，主要是检测核蛋白表达的差异。第二是对肿瘤干细胞特异性的标志物的研究，目前关于肿瘤干细胞的研究大多采用的是正常干细胞中常见的CD133或CD44等表面标志物，尚缺乏得到广泛认可的肿瘤干细胞表面标志物。第三是对肿瘤干细胞特异性药物靶点的筛选，筛选类似于EGFR的特异性靶点，也就是找到肿瘤干细胞与其他细胞表达不同的膜蛋白或者核蛋白。由此可见，目前肿瘤干细胞研究的关键问题就是要筛选到肺癌干细胞差异性表达的基因。目前筛选差异表达基因的常用技术方法有两个，一个是在基因水平的Microarray技术，另一个是在蛋白水平的蛋白组学技术。虽然Microarray技术可以揭示干细胞及肿瘤干细胞特定基因的表达谱，但却无法提供关于翻译后调控及蛋白质相互作用方面的信息［10］。而且，细胞内蛋白质表达水平的变化也不总是与mRNA水平的变化相对应［11］。因此，蛋白质组学分析被认为是研究肿瘤干细胞潜在药物靶点的重要途径［12］。

三、肿瘤干细胞蛋白质组学常用技术方法

蛋白质分离技术、生物质谱技术及生物信息学技术对肿瘤干细胞蛋白质组学的研究发展有决定性的影响，目前，常用的肿瘤干细胞蛋白质组学技术如下。

1．蛋白分离技术:双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物，构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”，分析蛋白质的表达状况，进行差异比较。2DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性好，便于计算机进行图像分析处理，可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，已成为目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。其他的蛋白质分离技术有液相色谱和毛细管电泳技术。尤其是新近发展的液相色谱技术可与质谱联用，具有高分辨率、可直接用于高复杂性蛋白质混合物的分析，对低丰度蛋白的检测能力超过了2DE［13］。

2．生物质谱技术:蛋白质组学研究中常用的质谱技术有:①基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术;②电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)技术;③表面增强激光解析离子化一飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术等。近来质谱技术与液相色谱联用(liquid chromatography/tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)有了较大发展，使其具有高敏感性和分辨率，检测范围较大等特点［14］。

3．生物信息学技术:生物信息学技术在蛋白质组研究中具有重要作用:①构建和分析双向凝胶电泳图谱;②数据库的搜索与构建;③目标蛋白的锁定。在得到大量的差异表达蛋白后，需要通过生物信息学技术对差异表达蛋白进行基因注释、比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等研究，为进一步的研究打下基础［15］。

四、肿瘤干细胞蛋白质组学研究进展

蛋白质组学研究现已在多种人类肿瘤组织或细胞系如肝癌、乳腺癌、结肠癌等癌症中开展，并已取得了一些成果，见表1。

表1 关于肿瘤干细胞蛋白质组学的总结列表Table 1 Summary of proteomics of cancer stem cells

1．造血系统肿瘤:肿瘤干细胞蛋白组学研究最早应用于造血系统肿瘤干细胞的研究。Ota等［22］通过表面标记物AC133从13个白血病患者的骨髓造血干细胞中分离出AC133(+)的肿瘤干细胞，利用双向电泳蛋白图谱，检测到11差异表达的蛋白点，利用质谱技术鉴定出10个差异表达蛋白，这些蛋白的功能涉及细胞周期调控、损伤修复、氧化还原反应的调节，包括NUMA(与有丝分裂器有关的核蛋白)、热休克蛋白(包括 HSPA5、HSPA8(p71)、HSPA8(p34)、HSPA9B)、ADA、ALDOA、TPI1、GST-pi、SOD2、PPIA。这些差异表达的基因为研究人类白血病的发病机制提供了很好的线索。

2．消化系统肿瘤:目前，蛋白质组学技术在消化系统肿瘤干细胞研究中的应用最多，涉及了结肠癌、肝癌、结肠癌肝转移，既包括有在细胞系基础上的研究，也有分离实体瘤肿瘤干细胞的研究。

在肝癌的研究中，通过表面标志物CD133分离肝癌细胞系Huh7中的肿瘤干细胞，应用双向电泳及质谱技术鉴定出6种差异表达蛋白，其中Transgelin基因的表达在肿瘤干细胞中增高25倍，且与肿瘤细胞的侵袭转移能力增高明显相关［16］。

在结肠癌的研究中，有研究通过无血清培养的方式分离出人结肠癌SW1116细胞中的肿瘤干细胞。分选出的肿瘤干细胞对紫杉醇、依托泊苷、顺铂等化疗药物的耐药性明显增高，且端粒酶活性明显增高，蛋白质组学技术鉴定出10种差异表达蛋白，功能涉及细胞周期调控、凋亡调控、增殖等［24］。值得引起关注的是，Fang等［17］首次将蛋白组学技术应用到实体瘤肿瘤干细胞的研究中，通过CD133从13例结肠癌手术切除标本中分离肿瘤干细胞，并以液相色谱串联质谱技术鉴定出CD44、CD166、CD29、CEACAM5、cadherin 17、CD133 及 biglycan 共七种结肠癌肿瘤干细胞特有的表面标志物。有研究者应用无血清培养基培养以形成干细胞球的方式在结肠癌肝转移的肿瘤组织中分选肿瘤干细胞，并通过1D和纳升级液相色谱串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术鉴定出32个差异表达基因，其中凋亡抑制基因BIRC6在肿瘤干细胞中表达显著增高，“敲低”BIRC6的表达后，肿瘤干细胞对奥沙利铂和顺铂的敏感性明显增高。

3．胚胎癌干细胞:Dormeyer等［19］采用电场轨道阱回旋共振组合质谱(LTQ-Orbitrap-MS)等技术发现胚胎干细胞HUES-7与胚胎癌细胞NT2/D1存在着不同的特异性胞浆蛋白，功能涉及信号传导、细胞连接、细胞转运功能等。Chaerkady等［20］发现胚胎干细胞(H1;WA01)及胚胎癌细胞NTERA-2 cl．D1表达差异在 2倍以上的蛋白有 200多种，包括 HSPB1，MAPK1，TPS3I11，NFKBIA，S100 calcium-binding protein-A4等基因，这些基因上调与恶性表型有关。Hayman等［23］采用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术，从维甲酸诱导分化前后的胚胎癌干细胞中筛选出4个特异的胚胎癌干细胞分化标志物。

4．乳腺癌:Steiniger等［18］采用H33342染色的方法从乳腺癌细胞MCF-7中分选出侧群细胞，蛋白组学技术发现41种差异蛋白在肿瘤干细胞中表达增高1．5倍，而有17种差异表达蛋白在肿瘤干细胞中表达下降1．5倍。

5．前列腺癌:Dai等［25］应用等电聚焦毛细管电泳(cIEF)及纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析技术，发现人前列腺癌裸鼠移植瘤的肿瘤干细胞中有169个差异表达基因，并通过生物信息学分析发现这些基因涉及凋亡、细胞增殖、炎症反应、转移等功能。Lee等［27］通过双向电泳及质谱分析的技术，发现人前列腺癌细胞DU145中肿瘤干细胞的Cofilin及Annexin A5的表达增高。

6．胶质瘤:Nilsson等［21］应用应用JAK2/STAT3磷酸化抑制剂WP1193处理恶性胶质瘤肿瘤干细胞GSC11，比较处理前后的差异表达蛋白，发现STAT3/IL-6/HIF1信号通路在肿瘤干细胞致瘤性及自我更新能力中有重要作用。

五、展望

虽然肿瘤干细胞蛋白质组学研究已有了一些应用，并取得了一些成果，但是该领域的研究才刚刚起步，还有很多的障碍需要克服。其中最重要的障碍就是肿瘤干细胞在肿瘤组织或细胞中的比例非常少，如何进一步提高富集的效率，提高蛋白质组学技术的灵敏性可能是研究的关键。其他的障碍也包括如何通过将包括样品收集和处理、数据处理等操作程序进行标准化以获得一致的研究结论等。蛋白质组学研究不仅有助于我们对肿瘤干细胞病理生理学特性的理解，也将为研发新的抗肿瘤药物、克服肿瘤的耐药、复发、转移提供有价值的线索。

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