金黄色葡萄球菌生物膜的研究进展

卢忠义(综述)，宋 鸿(审校)

(遵义医学院 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)

金黄色葡萄球菌生物膜的研究进展

卢忠义(综述)，宋 鸿(审校)

(遵义医学院 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)

金黄色葡萄球菌；生物膜；感染

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)常引起皮肤黏膜及多种组织器官的化脓性炎症，是医院内交叉感染的重要病原菌之一，也是生物膜感染常见的病原菌。由于细菌形成生物膜后其生物学性状、致病性及免疫性均发生明显变化，使感染慢性化并难以控制,为临床防治带来极大困难。因此，本文根据近年来的文献报道，对金黄色葡萄球菌生物膜的形成、结构及调控机制进行详细综述。

1 生物膜的定义及形成过程

生物膜(Bacterial biofilm，BF)是细菌在生长过程中为了适应环境的变化而附着在机体组织或生物材料表面形成的一种与浮游细菌相对应的生长方式，是由细菌群落和细胞外基质所构成，细菌一旦形成生物膜其生长、基因表达及蛋白质产物都会发生改变【1】。生物膜厚度的变化范围可以从一个单层细胞到许多黏液性多聚物包裹的细胞群落。对生物膜结构的分析显示，在某些情况下高密度的生物膜微菌落可以形成独特的柱状或蘑菇状结构。然而，也有一些生物膜结构的形成却依赖于环境因素【2】。生物膜通过错综复杂的通道网络为更深层的细菌输送基本营养物质，提供细菌代谢所需。虽然生物膜的形成不是持续感染的先决条件，但要清除却很困难，往往需要外科手术，因此对于生物膜的预防及消除还有待进一步研究。

金黄色葡萄球菌是一种分布广泛的革兰阳性细菌，常存在于人体前鼻腔。据统计，有20%～25%人群是金黄色葡萄球菌的长期宿主，75%～80%人群是间歇性宿主或从未侵入金黄色葡萄球菌【3,4】。之前的研究显示，鼻腔带菌与院内感染的增多有极大的因果关系。鼻腔为金黄色葡萄球菌提供了一个集结地去播散细菌，一旦细菌经破损的上皮进入血液循环系统，细菌开始繁殖，黏附因子表达也开始上调，侵入的葡萄球菌有可能被先天免疫防御系统清除，也有可能黏附于宿主细胞外基质蛋白形成生物膜。生物膜的形成最初来源于单个细胞，但在形成生物膜的过程中细胞的生理学特性逐渐向生物膜转变，在整个细菌群落形成过程中环境因素可以促进不同子群体生长，而在生物膜中由于受氧气、营养、电子受体梯度的影响可以导致差异的基因表达【5】。研究发现，葡萄球菌生物膜中的细菌可以同时存在四种代谢方式：需氧生长型，发酵型，休眠型(包括生长缓慢和停滞的细菌)和死亡细菌。位于表层氧气丰富的地方和下层营养丰富区域的细菌代谢比较活跃【5】。然而，绝大多数细胞是位于一个静止和缺氧环境下。此外，已证实了生物膜差异蛋白的表达跟多种细胞壁相关蛋白有关。在某些情况下，生物膜中细胞簇的这种差异表达可以设想为细胞间的基础。

生物膜嵌入有机组织生长的方式，比其浮游细胞更容易从周围获得营养物质。生物膜细胞外基质可以隔离和浓缩环境中的营养物质，如氧、氮、磷酸盐等。细菌生物膜形成是一个动态的过程，从最初的细菌定植到后来的粘附、聚集、分化成熟直到最后的播散，整个过程经历了五个具有不同特点的阶段。细菌首先在生物体或聚合物表面粘附，而后由于细胞间的相互作用聚集形成细菌团块，随着细菌的逐渐增多而形成相对成熟稳定的生物膜结构，随后生物膜中部分细菌离开菌群向远处播散，启动又一个生物膜形成过程。有学者认为，生物膜中的细胞存在一种选择优势(selective advantage)，其中部分细菌处于一种有利于播散的状态，在生存环境变化时即离开生物膜群体到更适宜的环境中定植。生物膜的播散有三种可能的形式：群游播散(swarming dispersal)、团块播散(clumping dispersal)和表面播散(surface dispersal )。但目前对于生物膜播散的调控机制仍不十分明确。

2 生物膜形成相关基因

金黄色葡萄菌可形成多层生物膜，生物膜中包裹了多种生物大分子如多糖、蛋白、DNA等，其生物膜的形成受到多种因子调节如多糖细胞间黏附素(poly- saccharide intercellular antigen，PIA)、葡萄球菌附属基因调节子(staphylococal accessory regulator，sarA)，附属基因调节器(accessory gene regulator，agr)、细胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)等。

2.1 多糖细胞间黏附素(PIA) PIA是金黄色葡萄球菌生物膜形成中最重要的因子，PIA是由胞间黏附素(intercellular adhesion，ica)操纵子表达产物共同催化合成的，由高分子质量多聚N-乙酰葡糖胺所组成，在生物膜形成聚集阶段起胞间黏附的作用。研究发现，金黄色葡萄球菌生物膜的形成存在着PIA依赖和PIA非依赖两条途径。

2.1.1 PIA依赖的生物膜形成ica基因座定位于细菌染色体，包括icaR调节基因及串联存在的icaA、icaB、icaC和icaD基因，其中icaA、icaB、icaC和icaD基因形成操纵子icaABCD，其转录产物为IcaA、IcaB、IcaC和IcaD四种蛋白，几乎100%的金黄色葡萄球菌临床分离株中都存在Ica操纵子。icaABCD操纵子的调控受到多种环境因素的影响，如 CO2、氧气、葡萄糖、乙醇、温度、渗透压及抗生素(如四环素)等 。研究发现icaABCD操纵子及其产物表达上调反应了细菌在缺氧条件下生长，如生物膜形成环境中【6】。这是由于在缺氧条件下呼吸反应调节因子SrrAB与icaADBC操纵子上游100bp处DNA序列相结合，激活PIA调节细胞的胞间粘附，可以使葡萄球菌在生物膜上聚集形成多层细胞。研究发现在表皮葡萄球菌的等位基因中，25%～30%变异株ica调节的发生是由于插入序列256(insertion sequence，IS256)发生相位变异，导致了回复突变，这种现象在一些金黄色葡萄球菌中也同样出现【7】。此外，PIA的表达还受到转录调节因子TcaR抑制。然而，敲除tcaR基因并不会影响PIA的合成【7】。环境因素对ica的调节主要是通过对IcaR的作用，IcaR是位于ica操纵子上游的icaR 编码的一个抑制因子。结合ica启动子和敲除icaR基因可以促进ica相关基因的表达【8】。除了IcaR 的调节外，还有其他的调控元件参与。

2.1.2 PIA非依赖的生物膜形成 尽管ica操纵子在生物膜形成发展中有着重要的作用，但葡萄球菌生物膜的形成却存在着另一条ica非依赖途径。arlRS双组件系统可以抑制生物膜发展，当敲除arlRS基因可以促进细胞粘附和PIA表达【9】。然而，生物膜的形成不会受到arlRS基因和ica操纵子双重缺失的影响，这提示了在这种双重缺失突变菌株中PIA并不是生物膜形成所必须的【9】。研究发现，金黄色葡萄球菌临床分离株—UAMS-1，在体外试验或体内导管感染模型试验中，甚至ica簇发生突变，都不会减弱生物膜的形成【10】。 在生物膜感染模型中，ica缺失会减少PIA的表达，但不会降低毒力【11】。此外，也有研究发现，当ica缺失，不会影响甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)BH1CC生物膜的形成，然而另一些突变株却失去了形成生物膜的能力。值得一提的是，依据对甲氧西林敏感性，将金黄色葡萄球菌ica操纵子缺失突变株分为MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Methicillin sensitive staphylococcus aureus，MSSA)，MRSA菌株能够形成生物膜，相反MSSA菌株形成生物膜能力却很弱。这些数据显示，在ica的非依赖途径中生物膜形成具有菌株特异性。此外，研究发现葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)是ica操纵子缺失突变株生物膜形成的必须因素。在SPA缺陷突变株中加入外源性SPA可以恢复生物膜的形成能力。纤维粘连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding proteins，FnBPs)在生物膜的形成中也起到重要作用。在表皮葡萄球菌中，PIA非依赖途径生物膜形成可通过聚集相关蛋白(accumulation-associated protein，Aap)的调节。除此之外，生物膜相关蛋白(biofilm-associated protein，Bap)也与金黄色葡萄球菌生物膜的形成有关。这些研究显示在ica非依赖的生物膜形成中细胞间粘附蛋白可以代替PIA介导生物膜的形成。

2.2 eDNA与生物膜的形成 葡萄球菌生物膜的另一个重要组份是eDNA，它最早是在铜绿假单胞菌生物膜中发现的。在体外采用DNA酶可以清除早期的、未成熟的生物膜，而临床使用DNA酶联合抗生素成功治愈了囊性纤维化患者，并且发现在皮肤细胞中有DNA酶存在可以减少生物膜的形成，这些现象说明了eDNA是生物膜的重要组成成分。cidA是一种编码胞壁质水解酶活性效应器及调节细胞死亡的基因，Rice【12】等研究发现cidA的突变可以导致生物膜整个基因组DNA水平降低、粘附性下降。DNA酶I对cidA突变株生物膜形成的影响很小，而对其亲代菌株则表现出明显的抑制效应。cidA基因已经被证实是一种与细胞裂解有关的穿孔素同源基因，这些资料表明DNA释放和生物膜的发展都必需依赖于细胞裂解【12】。此外，研究也发现，细胞的裂解和随后基因组DNA的释放都必须发生在生物膜形成早期—细胞粘附阶段。eDNA不仅参与生物膜的形成，eDNA还能通过螯合阳离子增加生物膜的耐药性【13】。

lrg是另一种与胞壁质水解酶和细胞死亡有关的调节基因，研究发现lrgAB菌株发生突变，可以通过提高生物膜粘附力及相关eDNA表达，而抵消cidA基因介导的DNA释放效应。在金黄色葡萄球菌生物膜还普遍存在着另外一些上调基因，如自溶素和噬菌体基因组。因此，金黄色葡萄球菌可以通过多种模式释放eDNA形成生物膜。细胞裂解与eDNA的释放将成为金黄色葡萄球菌生物膜复杂调节机制的另一个重要研究方向。

2.3agr与sarA调控生物膜的形成agr和sarA是金黄色葡萄球菌生物膜形成中主要的总体性调节因子。一种双组件调节感受器由arlRS编码，是应答调节器OmpR-PhoB家族成员，受到agr和sarA基因调节。当基因表达上调时，arlS基因产物可能通过影响肽聚糖水解酶的活性而调节细菌黏附于聚合物表面，阻碍生物膜形成。与浮游菌相比，生物膜中sarA基因表达上调，而在sarA突变株中生物膜形成能力降低。当sarA突变株中nuc基因和胞外蛋白酶转录上调时，同时使耐热核酸酶和nuc基因发生突变，或加入蛋白酶抑制剂，能使sarA突变株恢复生物膜形成能力【14】。通过抑制nuc基因表达或蛋白酶活性，sarA基因可以阻碍生物膜结构中两个重要组分—eDNA和蛋白质降解。

虽然，SarA蛋白一方面影响agr基因表达，另一方面又受到agr基因调控，但agr基因的突变对生物膜形成影响却很小，研究发现还存在着另一种不依赖于agr的对生物膜形成进行调节的方式【15,16】。尽管如此，这些研究仍显示了agr基因与生物膜形成是相关的。Agr群体感应系统是细胞壁相关粘附因子的下调基因【17】，它将导致细菌粘附性降低，影响生物膜早期形成。因此，agr的抑制是生物膜形成所必需的，而通过细胞外成熟的“自动引导多肽(Auto-inducing peptides，AIP)”激活agr系统可导致成熟生物膜的散播【18】，由于蛋白酶抑制剂和抑制的AIP阻碍生物膜散播，因此这种机制的产生往往依赖于蛋白酶及激活agr系统【18,19】。此外，agr基因使类似洗涤剂肽和核酸酶表达上调，这样看起来可以增加生物膜的播散。

总之，在一种互补和对立的模式中葡萄球菌的总体性调节因子功能通过抑制核水解和蛋白胞外酶，sarA基因能促进细菌黏附及早期生物膜的形成，一旦生物膜达到一定的感知密度，agr基因表达导致许多毒力因子上调阻碍宿主免疫应答，此外，agr基因以一种核酸酶、蛋白酶及洗涤剂依赖方式使生物膜播散。

3 展望

金黄色葡萄球菌形成生物膜是一个复杂的过程，需要多种因子的参与，并受到多种基因及其产物的共同调控。但目前国内对金黄色葡萄球菌生物膜的研究主要集中在对粘附现象的观察、对生物材料表面抗粘附的研究及生物膜形成阶段、组成及生物膜所导致相关疾病的研究上，而对生物膜形成基因调控方面的研究明显不足。因此，需要更加深入地探索与金黄色葡萄球菌生物膜形成相关的机制基因组，为临床有效治疗金黄色葡萄球菌引起的感染提供新的理论参考。

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贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合G字LKZ【2011】37)。

宋鸿，女，副教授，研究方向：病原微生物与疾病研究，E-mail:song-77@qq.com。

R378.99

A

1000-2715(2012)05-0464-04

【收稿2012-08-28；修回2012-09-15】

(编辑：王福军)