四味藏木香软胶囊中土木香内酯在人源Caco－2细胞单层模型中的吸收研究

安 涛，何 贺，郭海慧，王洪星

（青海大学 医学院，青海 西宁 810001）

四味藏木香软胶囊由藏木香、悬钩木、宽筋藤、干姜四味药组成，主要功能是治培根型木布病和促使瘟病初期的疫热成型、虚热症、血痛病及涎痰病，呼吸不畅，食欲不振，两肋刺疼，混合传染病。研究表明，土木香内酯（C15H20O2）是藏木香的主要活性成分之一。Caco－2细胞系源于人的结肠癌，其体外作用过程与药物在小肠的吸收具有相关性，因此，广泛应用于揭示小肠上皮吸收的限速因素，评价药物的吸收性。本实验试图通过对四味藏木香软胶囊中药物有效成分经肠吸收动力学方法研究，以弥补市场上只有此药汤散剂的不足，进一步提高藏药的疗效，扩大使用范围，减少使用剂量，方便给药，为改进传统藏药剂型提供一定依据。

图1 土木香内酯的化学结构式

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞株Caco－2（ATCC＃HTB－37）购自美国 ATCC，土木香内酯（110760－201004）对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯，北京化工厂）、缓冲溶液（Hank＇s balanced salt solution，HBSS），实验用二重水。四味藏木香软胶囊（由青海大学医学院中藏药研究中心制作，批号批号201112）；DMEM 培养基（DμLbecco＇s modified Eagel medium，Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，equitech－Bio Inc.公司）；胰蛋白酶（Trypsin）购自北京华美生物工程公司；非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）购自美国Hy－clone公司；萘洛尔（proprnaolo1）、阿替洛尔（atenolo1）。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪（日本岛津），LC－10AT 泵，ZA－100进样器，N2000工作站，SPD－10A检测器，SY1200T超声波清洗器，ZF－1型三用紫外分析仪；电子分析天平（FA1004，上海良平仪器仪表有限公司）；ZS－H型恒温水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；TGL－16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养条件

Caco－2按“Caco－2细胞模型和标准操作规程”，采用内含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和青霉素－链霉素双抗液的高糖DMEM培养基。将Caco－2细胞接种37℃含5%CO（相对湿度90%）培养皿中培养，每天换液，约5d后按1∶5比例传代。将细胞按一定密度接种在Millicell膜上，种植密度为1×105个／cm2，种植后每天换一次液，培养至21～23d，体外培养至融合经检测合格后，即可用于药物的吸收、转运和代谢试验。本实验选择43～44代，电阻＞25Ω／cm2的Caco－2细胞单层。

1.3.2 摄取、转运与外流实验

将土木香内酯溶于甲醇中制成储备液，实验前以HBSS缓冲液稀释至所设计的剂量浓度，分别在细胞两侧加入受试化合物和HBSS溶液（AP侧400μL，BL侧1200μL）。AP侧给药为摄取和转运实验；BL侧给药为外流实验。用药后于恒温摇床（37℃ ，50r·min－1）上温育。土木香内酯的给药量为40μmol，温育90min，分别收集AP侧或BL侧的溶液，单孔取点，每点平行3个孔。当AP侧给药时，给药端AP侧取样300μL，接受端BL侧取样1100μL；当BL侧给药时，给药端BL侧取样400μL，接受端AP侧取样350μL。所取样品经冷冻干燥后分别加入不同体积的甲醇，给药端均加入300μL，接受端均加入100μL，漩涡混匀后超声溶解50min。离心20min，取上清液，用HPLC测定。

1.3.3 HPLC色谱条件

色谱条件：高相液相色谱仪：色谱柱：C18柱，4.6m×150mm，5μm；测定波长：220nm；柱温：20℃ ；流动相：乙腈∶水＝55%∶45%；流动相流速：1mL／min。进样量10μL。

1.3.4 表观渗透系数的计算

土木香内酯在Caco－2细胞单层模型中的值按下式计算：Papp＝（dQ／dt）／SC。dQ／dt为接收池药物出现的速率，S为膜面积，C为药物的初始浓度。P值越大，通透率越高。用t检验对两组数据进行比较处理。

2 结果

2.1 土木香内酯分析方法建立

精密称取土木香内酯25.00mg，置25mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，配成1.00mg·mL－1的储备液。精密吸取储备液30μL加最后一次洗细胞的HBSS稀释到3mL，再从中依次取1000、600、500、400、300、200、100μL，分别用 HBSS稀释至1mL，冷冻干燥，加入甲醇溶解并定容为1mL；各浓度点取20μL，进样分析。得到土木香内酯在浓度范围0.1～1.0mg·mL－1内峰面积（Y）与浓度（X）的线性回归方程为Y＝9.12×107X＋2.2×106，相关系数r＝0.9988。

图2 土木香内酯对照品和转运药物的HPLC色谱

2.2 回收率实验

AP侧给药，土木香内酯的给药浓度为40μmol·L－1。温育90min后，取AP侧或BL和BL侧或AP侧液，按“1.2.2”项方法处理，按项“1.2.3”进行测定，按“1.2.4”项方法计算，得土木香内酯的平均回收率为95.80%，RSD＝1.03%。

2.3 摄取转运实验结果

AP侧或BL侧给药，土木香内酯的给药浓度皆40μmol·L－1。培育90min后，分别取AP侧或BL侧和BL侧或AP侧液，按“2.1”项方法处理，进行测定，按“2.2”项方法计算，土木香内酯AP侧到BL侧和从BL侧到AP侧的P值，结果见表1。同理在模型中用普萘洛尔（proprnaolo1）、阿替洛尔（atenolo1）做比较。

表1 土木香内酯在Caco－2细胞单层模型中的Papp值

3 讨论

土木香内酯是四味藏木香软胶囊的主要有效成分之一，具有多种药理活性。本研究通过Caco－2细胞模型，研究土木香内酯跨膜转运的机制从而探讨土木香内酯小肠吸收转运的机制，初步阐明土木香内酯在小肠中吸收的机制和药物吸收的难易程度。建立土木香内酯在Caco－2细胞单层模型中的HPLC检测方法，土木香内酯的峰面积与质量浓度线性关系良好，线性范围为0.1～1.0mg·mL－1。应用该方法分别测定了AP侧给药转运90min，时间点AP侧和BL侧液中原形土木香内酯的总残存量，回收率（AP侧和BL侧的总和）为95.80%，说明它们在Caco－2细胞内基本无蓄积或仅有少量蓄积，对实验结果分析不会产生影响。

根据文献报道，在Caco－2细胞单层模型中，一般来说人体吸收完全的药物Papp值大于10－5cm·s－1，而吸收差的药物Papp值小于10－5cm·s－1，在此模型中我们将转运良好的阳性药物普萘洛尔和难吸收的药物阿替洛尔的Papp值进行测定，得到普萘洛尔的Papp值为（2.32±0.11）×10－5cm·s－1；阿替洛尔的Papp值为（2.04±）×10－5cm·s－1与文献报道的数据接近，而从表1我们可知土木香内酯的表观渗透系数在吸收良好的药物的范围内，从肠腔侧进入体循环（内流）与从体循环进入肠腔侧（外流）的数据相差不大，并且PappA－B／PappB－A为0.67，在0.5～2.0之间，所以双向转运差异不大，初步说明土木香内酯在小肠上属于被动转运，受生物大分子的影响较小。因此，这些结果对四味藏木香软胶囊的口服提供了一定的实验和理论基础。

近年来，土木香内酯被发现具有止痛作用，土木香根的甲醇提取物对人胃腺癌细胞（Mk－1）、人子宫癌细胞（HeLa）和鼠黑素瘤细胞（B16F10）具有抗增殖作用，此次在Caco－2细胞单层模型中的研究将对今后土木香内酯在这些疑难杂症的研究方面提供一定的参考依据。

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