噬菌体抗体库及其在检验检疫中的应用

邢佑尚 汪 琳 赵胤泽 王慧珊

(1.沈阳农业大学辽宁沈阳110886;2.北京出入境检验检疫局)

1 前言

抗体库(antibody library)技术是用PCR技术得到抗体全套重链和轻链可变区基因，将得到的目的片段重组到特定的表达载体中，最后转入原核或真核生物体内以表达有功能的抗体分子片段，并通过亲和筛选获得特异性抗体的技术。抗体表型与基因型的统一，从构建的抗体库中找到编码针对特异抗原的基因是抗体库技术的核心内容［1］。抗体库技术的产生基于三项关键技术的突破:一是PCR技术使人们能够利用引物得到全套抗体相关可变区基因;二是利用大肠杆菌表达出了具有特异抗原抗性的重组抗体分子;三是噬菌体表面重组蛋白展示技术的成功建立［2］。抗体库技术较传统细胞融合杂交瘤技术制备单抗有着天然技术上的缩短抗体制备周期的优势，跳过了杂交瘤细胞融合步骤而自然避免了因杂交瘤细胞丢失和不稳定问题;扩大了筛选容量，将抗体库的克隆基数一般在106以上，远超杂交瘤细胞;抗体库技术制备的抗体是表型和基因型的统一，便于进一步构建各种基因工程抗体;抗体库技术得到的抗体可利用原核表达系统的优势表达;一些针对弱免疫原、毒性抗原、人源抗体等难于制备的抗体都可以得到解决。抗体库技术由于通最高、周期短、可控性好、路线多样，因而成为开发抗体最具发展活力的领域［3］。

根据抗体库展示平台的不同可以分为:噬茵体展示、核糖体展示、酵母展示、细菌展示、杆状病毒展示和哺乳细胞展示。不同的展示平台具有各自的优缺点，其中噬菌体抗体库以噬菌体和细菌为对象，易操作，成本较低.是技术最成熟、商业应用最成功的展示平台［4］。

2 噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库展示技术是一种用于蛋白质或抗体筛选的新技术，其基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因中，使外源DNA片段的表达产物与噬菌体的外壳蛋白融合，展示于噬菌体表面［5］。噬菌体展示技术的第一次出现是1985年，Smith G P将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，在噬菌体表面展示了以融合蛋白形式表达的目的基因编码的多肽。1988年Parmley将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢ N端融合呈现在其表面。1990年Mc Cafferty用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功，开创了噬菌体展示技术广泛应用的时代［6］。

2.1 噬菌体抗体库所用的噬菌体

噬菌体展示技术中常用的噬菌体为溶原性的丝状噬菌体，如M13、f1和fd，这些噬菌体为圆柱型，具有约6.5nm的直径，它的长度则由基因组的大小决定如Fd噬菌体长930nm，而只有221个核苷酸的微噬菌体变种则只有50nm长，它的外壳蛋白包裹在噬菌体的外部。噬菌体主要外壳蛋白为 gⅧ蛋白，共有2700个拷贝。噬菌体的一端有gⅢ和gⅥ蛋白蛋白，主要作用是感染革兰阴性菌;另一端有gⅦ和gⅨ蛋白，这4种蛋白在噬菌体中均有5个拷贝［7］。除了丝状噬菌体外，其他的溶菌性噬菌体如λ噬菌体、T4、T7噬菌体也有应用。这些噬菌体可用于cDNA文库的展示，尤其是T7噬菌体，近些年来应用越来越广泛，将目的基因与T7外壳蛋白的基因融合，可在 T7表面展示高达400拷贝的大分子量蛋白质。

2.2 噬菌体抗体库所用的衣壳蛋白

噬菌体抗体库所用的衣壳蛋白有丝状噬菌的PⅢ蛋白、PⅧ蛋白和PⅥ蛋白，λ噬菌体的PV蛋白和D蛋白以及T4噬菌体的SOC(9 ku)和HOC(40 ku)外壳蛋白。

2.2.1 PⅧ蛋白展示系统

丝状噬菌体的主要衣壳蛋白PⅧ蛋白在噬菌体颗粒中存在几千个拷贝。PⅧ蛋白展示的好处是拷贝数多，展示的抗体遍布于噬菌体的表面，PⅧ仅有50个氨基酸，抗体所受空间位阻小，特异性结合力强。PⅧ的N端附近可融合6－8个残基的短肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配［8］，使其失去感染力，但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。Sidhu，SS等使用经过改造的PⅧ蛋白在多拷贝的情况下表达了更大的多肽［9］。

2.2.2 PⅢ蛋白展示系统

PⅢ蛋白展示系统是丝状噬菌体的另一展示系统，同时也是噬菌体展示最受欢迎的展示系统，其以5个拷贝数量展示于病毒颗粒末尾，并且它能允许大片段的插入能与单价展示相容，有大量使用的载体。PⅢ有2个位点可供外源序列插入，PIII很容易为蛋白水解酶水解。所以有辅助噬菌体超感染时.可以使每个噬菌体平均显示不到一个融合蛋白，称为单价噬茵体，从而使抗体部分最大限度地保持原构型而功能完好。PIII展示系统的主要用途是制备噬茵体抗体，它的突出优点是模拟了自然免疫选择系统。此外，尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的研究报道［10］。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能，该系统主要用于cDNA表面展示文库的构建，并取得了不错的筛选效果。

2.2.3 PV蛋白和D蛋白展示系统

PV蛋白和D蛋白都是λ噬菌体蛋白，λ噬菌体的尾部管状部分主要由PV蛋白构成，用于表达的外源序列插入或替换PV两个折叠区域中C端的折叠结构域(非功能区)，λ噬菌体PV蛋白展示的优点是其装配在细胞内进行，能够展示难以分泌的肽或蛋白质。用PV蛋白系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β－半乳糖苷酶(465 ku)和植物外源凝血素BPA(120 ku)等。D蛋白是λ噬菌体另外一种用于展示系统的蛋白，其以三聚体的形式突病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD－噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD－溶源的大肠埃希菌菌种中，从而补偿溶源菌所缺的D蛋白，通过热诱导而组装。该系统有一个很大的特点，噬菌体上D蛋白和融合蛋白的比例可通过宿主抑制tRNA活性加以调节，这对于展示那些对噬菌体装配有损害作用的蛋白质时特别有用［11］。

2.2.4 SOC和HOC蛋白展示系统

T4噬菌体的两种非必需外壳蛋白SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)，其显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。不需要分泌途径，因而其表面展示多肽和蛋白质的范围广，很少受到限制。在DNA包装被抑制时，T4噬菌体是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。因此，在用重组T4做疫苗时，它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景［12］。

2.3 噬菌体抗体库类型

2.3.1 非免疫噬菌体抗体库

非免疫抗体库不针对特定抗原，而是作为一个无偏向性的筛选平台，因此必须具有很高的库容最和多样性［13］。按照抗体可变区基因来源，非免疫抗体库分为天然抗体库、部分随机化抗体库、完全随机化抗体库。

天然抗体库的基因主要来源于B细胞，包括前、成熟、记忆B细胞，常从骨髓、脾、淋巴结、外周血中提取。获取全套抗体基因引物设计思路通常有3种:一是在框架区FR1和FR4或J区(铰链区)设计引物，其缺点是引物区引入的氨基酸突变对抗体的亲和力有潜在影响;二是利用RACE技术，其特异引物可针对C区或polyA区，用此方法也可获得真实的V区序列，而且不易漏过可用的抗体基因，但操作繁琐;三是在信号肽和C区设计引物，克隆后测序，再在FRl和FR4根据测序的结果设计引物，可获得完全真实的V区序列，但信号肽序列变化较大，不易设计［14］。

部分随机化抗体库，是在某一天然抗体基因的基础上保持抗体的大体结构不变，一般4个FR和CDRl、CDR2区不变，只针对最关键的CDR3区进行随机化操作［15］。

完全随机化抗体库保留抗体的FR不变，对全部的CDR区随机化合成。FR来源于已知的天然抗体基因或人工设计，要求具有很高的序列通用性且能够适应多样的CDR结构。完全随机化抗体库的多样性最高，但同时也对库容量有更高的要求，因此操作难度较高［16］。

2.3.2 免疫噬菌体抗体库

免疫噬菌体抗体库的抗体基因来源于使用抗原免疫过的个体，因此存在免疫偏向性，相比非免疫抗体库较容易从该类抗体库中筛选到针对某一抗原的特异性抗体。其存在的缺点是由于免疫本身的偏向性和限制性，制备针对弱抗原、自身抗原、毒性抗原的抗体比较困难，且某一特定的抗体库只能产生针对特定抗原趋向的抗体，无法作为一个广泛的技术平台加以应用［17］。

2.4 噬菌体抗体库分子类型

抗体库技术产生的抗体以小分子抗体为主，根据抗体分子类型，可将抗体庠分为Fab库、单链抗体(scFv)库、微型抗体库、单域抗体(single－domain antibody)库、最小识别单位(MRU)库等［18］。

Fab片段是由重链(VH－CH1)和轻链(VLCL)组成的异二聚体，片段大小为完整抗体的1/3。与其他小分子抗体相比，虽然体积较大，但是却能够最好地保留抗体的亲和力，因而目前应用最为成功［19］。

单链抗体(scFv)是在抗体重链(VH)与轻链(VL)之间用连接肽(1inker)连接而形成，大小为完整抗体的1/6。(Gly4Ser)3为常用连接肽，具有较好的疏水性和伸展性，不影响抗原结合部位的构象。其优点是分子量小，穿透力强，近年来scFv的应用趋于成熟。

单域抗体由VH或VL组成，大小为完整抗体的1/12。与VL相比，大多数单独的VH保留了较好的抗原结合能力和专一性，然而由于暴露了原先与VL结合的疏水性，须改造其中的一些氨基酸位点。

3 噬菌体抗体库在检验检疫中的应用

目前世界各国间贸易量飞速增长，我国的出入境产品也迅猛增长，在此前提下，如何实现出入境产品的快速通关，实现我国大通关的战略是亟待解决的问题。目前免疫检测在检测方法占据了极其重要的位置，得到了最为广泛的应用，然而传统免疫或杂交瘤等途径获得抗体费时费力，且无法满足制备各种高密度大通量蛋白检测的需要。新兴的噬菌体抗体库技术可以快速、廉价、高通量地获得产量高，活性强，特异性好克隆抗体。研究者们为噬菌体抗体库用于检测方面做了许多开创性研究。

在生物寄生虫检测方面，张慧林等利用经日本血吸虫可溶性虫卵抗原和成虫抗原免疫的BALb/c小鼠脾脏作为cDNA来源，利用免疫噬菌体抗体库技术得到抗体库，然后分别以免疫鼠血清IgG和正常鼠血清IgG包板，将得到的抗体库依次孵育后使用抗原筛选，进行六轮富集洗脱后，从最后一次筛选得到的细菌集落中随机挑选80个克隆，用ELISA鉴定，将阳性克隆进行可溶性表达［20］，从上述库中筛选获得四株日本血吸虫抗独特型抗体，对其中一株(C12)进行了可溶性表达，用SDS－PAGE电泳初步鉴定，然后经 ELISA鉴定出四株(C12、C19、D1、D2)抗日本血吸虫独特型抗体。黄会、詹希美等成功的构建了库容为3.46×106的鼠源性抗恙虫病东方体的噬菌体Fab片段抗体库，试验以感染恙虫病东方体小鼠的脾细胞中的RNA为模板逆转录后，PCR扩增出抗体轻链和重链目的基因，将表达载体pComb3和轻链目的片段进行双酶切、连接，转化入大肠杆菌XL1－blue，得到轻链库;再对重链目的基因和轻链重组质粒进行双酶切、连接，转化入大肠杆菌XL1－blue，构建组合文库，用辅助噬菌体VCSM13进行超感染。用恙虫病东方体特异性抗原进行筛选，经过4轮富集筛选，抗体库中的目的抗体得以富集约160倍，并用ELISA法对其进行鉴定，得到了7 个阳性克隆［21］。

在转基因产品检测方面，王耘等利用噬菌体抗体库技术筛选抗CrylAc蛋白单链抗体，为CrylAc蛋白蛋白检测开辟了一条新的制备路线。其制备的抗体库经辅助噬菌体M13K07扩增后，系列稀释测定其滴度为1.0×1017pfu/L，以CrylAc蛋白为抗原包被固相，经4轮富集扩增过程后，挑取单克隆，用ELISA法测定特异性结合活性，并对其进行基因序列测定。经过4轮筛选，获得了2株能与CrylAc蛋白特异性结合的阳性克隆［22］，为CrylAc毒素蛋白检测提供了条件。

在产品药物残留检测方面，由于抗体检测的简便、快速、灵敏、价廉等优点，噬菌体抗体库技术具有很大的应用潜力。沈建忠等构建了库容量为6.5×106噬菌体scFv单链抗体库，经过三轮富集后通过Phage－ELISA技术成功筛选出了9个抗庆大霉素噬菌体阳性克隆。郑志明等应用噬菌体展示和重组抗体技术构建了库容为1.3×106的抗诺氟沙星单链抗体库，噬菌体中scFv插入率为90%，制备抗诺氟沙星单链抗体库，筛选得到5株抗诺氟沙星的阳性克隆。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础［23］。

鉴于噬菌体抗体库技术的大容量性和生物芯片的高通量性，将噬菌体抗体库技术和生物芯片技术相结合应用于检测领域必将为检验检疫工作带来革命性的提高，在生物芯片检测方面，人们最初尝试了PⅢ展示系统制作的抗体检测芯片，后来廖玮等人比较了噬菌体PⅢ和PⅧ展示系统制作的凝血酶特异的单链抗体芯片，比较不同展示系统对噬菌体抗体芯片的特异性及灵敏度的影响，结果表明PⅧ展示系统阳性对照的荧光信号增加了PⅢ展示系统的26倍，而阴性抗原对照的荧光强度降低为PⅢ展示系统的1/65，作为对照的阴性噬菌体强度基本没有变化，在PⅧ展示系统中，阳性对照与阴性抗原和阴性噬菌体的荧光强度比由原来的2:1:1提高为3000:1:50［24］。为解决噬菌体展示的展示效率低、拷贝数少和偶联后噬菌体倒伏在芯片上的问题提供了解决方法，进一步为噬菌体抗体库技术在抗体芯片的应用扫平了障碍。生物芯片技术的高通量特性结合抗体库技术的高库容特征，二者的结合为高密度高通量蛋白的检测提供了有效地解决途径。

在利用单重链噬菌体抗体库方面，严安、孙冰玉等构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链可变区抗体库(VHH型抗体库)并从中筛选到了抗H5N1的噬菌体VHH型抗体，利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼四次后，其外周血清中抗体血清抑制效价可达1:2560，构建的VHH抗体基因库库容可达3×108，随机挑选14个抗体基因克隆进行测序鉴定，结果显示均为独立克隆。上述基因库经辅助噬菌体拯救后，得到抗H5N1的噬菌体VHH型抗体初级库，对初级库进行血凝抑制试验，结果呈阳性，表明初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1抗体［25］。

4 噬菌体抗体库在检验检疫中应用前景展望

综上所述，噬菌体抗体库技术在检验检疫领域显示出极大的应用前景，特别是噬菌体抗体库的大容量、单体展示的特点为免疫检测提供了比传统杂交瘤细胞制作抗体更为方便、快捷、大批量的制备方法，结合近年来发展的高通量检测技术平台，如抗体固相芯片、悬浮芯片技术，可以为检验检疫工作领域带来突破性提高。如对于不同亚型的病毒检测可以利用噬菌体抗体库技术筛选对应不同亚型的单抗，然后制作高通量的亚型检测芯片，将噬菌体抗体库筛选的同一种属不同亚型的抗体(Scfv/Fab)集中于一张芯片上，实现一次检测排查所有已知此种病毒的目的。同时对于病毒变异快的问题，非免疫抗体库技术提供了无倾向性抗体筛选平台，无论病毒变异与否，都能筛选到合适的抗体，缩短应对病毒变异后抗体研制的时间。对于国内外突然爆发的疫情，以往要花费较长的时间进行相应抗体的获得，应用噬菌体抗体库技术的平台可以很快获得大量相应抗体，赢得应急反应时间。

噬菌体抗体库技术应用于检验检疫领域有着天然的锲合优势和光明的前景，当然也存在一些技术瓶颈和需要完善的方面，库容量是噬菌体抗体库的优势但同时也是其技术瓶颈，一般库容达到109以上，就能接近生物体内天然抗体基因的数量级，因此在保证库容量的前提下应尽量提高库的分子多样性，这样才能够筛选到针对不同抗原的抗体。另外抗体库产生的抗体亲和力有待进一步改造提高，目前常用随机进化策略如易错PCR(error－prone PCR)、DNA 改组(DNA shuffling)、链交换、形态建成(morphogenics)等方法，以及定向进化策略如计算机模拟定点突变等提高抗体的亲和力。

噬菌体抗体库技术作为一种新的蛋白研究、抗体研制的方法，必将在检验检疫领域的基础研究和实际应用中产生深远影响。

［1］ Cott JK，Smith G P，Searching for peptide 1igands with an epitope 1ibrary［J］.Science，1990，246(4909):386 －390.

［2］ Skerra A，Pluckthurn A.Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia Coli［J］.Science，1988，240(4855):1038－1040.

［3］ Hoogenbcom H R.Selecting and screening recombinant antibody libraries［J］.Nat Biotechnol，2005，23(9):1105 －1161.

［4］ Thie H，Meyer T，Sehirrmann T，et al.Phage display dedved therapeutie antibodies［J］.Curt Pharm Biotechnol，2008，9(6):439－446.

［5］ Winter G，Milstein C.Man made antibodies［J］.Nature，1991，349:293－299.

［6］ Mc Cafferty J，Griffiths AD，Winter G.Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains［J］.1990，348(6):552－554.

［7］ Gao C，Mao S，Kaufmann G，et al.A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(20):12612 －12616.

［8］ Iannolo G，Minenkova O，Petruzzelli R，et al.Modifying filamentous phage capsid:limits in the size of the major capsid protein［J］.Mol Biol，1995，835:248.

［9］ Sidhu S，Weiss G A，Wells J A.High copy display of large proteins on phage for functional selections［J］.Mol Biol 2000，296(5)，487 －495.

［10］ Mao C，Flynn C E，Hayhurst A，et al.Viral assembly of oriented quantum dot manowires［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(12):6946－6951.

［11］ 郭强，程度胜.噬菌体羧基端展示系统［J］.生物技术通讯，2002，13(4):322 －324.

［12］ Ren Z J，Black L W.Phage T4 SOCand HOCdisplay of biologically active，full－ length protein on the viral capsid［J］.Gene，1998，215(2):439 －444.

［13］ Cesaro－Tadic S，Lagos D，Honegger A，et a1.Turuover－based invitro selection and evolution of biocatalystsfrom afully synthetic antibody library［J］.Nat Bioteehnol，2003，21(6):679 － 685.

［14］ Li J，Sai T，Berger M，et a1.Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybfidoma technology［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(10):3557 －3562.

［15］ Deroo S，Fischer A，Beaupain N，et a1.Non － immunized natural human heavy chain CDR3 repertoires allow the isolation of highaffinity peptides mimicking a human influenza hemagglutinin epitope［J］.Mol Immunol，2008，45(5):1366 － 1373.

［16］ Rothe C，Urlinger S，Lohning C，et al.The human combinatorial antibody library HuCAL GOLD combines diversification of all six CDRs according to the natural immune system with a novel display method for efficient selection of high－affinity antibodies［J］.Mol Biol，2008，376(4):1182 －1200.

［17］ Wrammert J，Smith K，Miller J，et a1.Rapid cloning of high affinit human monoclonal antibodies against influenza virus［J］.Nature，2008，453(7195):667 －671.

［18］ Hudson P J，Souriau C.Engineered antibodies［J］.Nat Med，2003，9(1):129 －134.

［19］ Carter P J.Potent antibody therapeutics by design［J］.Nat Rev lmmunol.2006，6(5):343 －357.

［20］ 张慧林，焦永军，朱进，等.大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定［J］.南京医科大学学报(自然科学版)，2006，26(09):43 －45.

［21］ 黄会，詹希美，郑小英，等.抗恙虫病东方体噬菌体抗体库的构建和初步筛选［J］.热带医学杂志，2008，8(3):45 －47.

［22］ 王耘，刘媛，王祥，等.从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac蛋白单链抗体［J］.细胞与分子免疫学杂志，2009，25(12):1146－1148.

［23］ 郑志明，金社胜，肖希龙，等.抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选［J］.动物医学进展，2010，31(S):36 －41.

［24］ 廖玮，洪龙，魏芳，等.利用PⅧ展示系统改进噬菌体抗体芯片［J］.物理化学学报，2005，21(5):508 －511.

［25］ 严安，孙冰玉，夏立亮，等.抗H5N1禽流感病毒VHH抗体库的构建［J］.中国免疫学杂志，2011，27(1):50－51.