基因工程抗体亲和力成熟研究进展

于礼，梁米芳

·综述·

基因工程抗体亲和力成熟研究进展

于礼，梁米芳

自 1975 年，Kohler 创建杂交瘤技术并成功制备单克隆抗体以来，人们已研制出数以千计的单克隆抗体。单克隆抗体因其高度的靶向特异性已经成为科学研究，疾病诊断，药物靶向治疗等不可或缺的工具。由于杂交瘤技术制备单克隆抗体为鼠源性，在人体应用时易发生免疫排斥反应，难以有效激发人体免疫效应，而人源的基因工程抗体很好地解决了这一问题。借助 DNA 重组和蛋白质工程技术，人们可以获得人源单克隆抗体，并可在基因水平对抗体进行拼接、修饰、重新组装成为一种新型抗体。目前美国 FDA 已批准22 种单克隆抗体药物，主要用于肿瘤、病毒和炎症性疾病的治疗，并且现有超过 200 种单克隆抗体正进行临床试验。抗体作为药物蛋白极具市场价值，2007 年抗体产业市值超过 270 亿美元[1]，2010 年市值已超过 480 亿美元，已经成为生物治疗行业的新兴产业和重要支柱。自基因工程抗体问世以来，人们发现某些抗体虽具有良好的结合特异性，但缺乏亲和力，尤其由天然噬菌体抗体库制备的抗体没有经过抗原诱导的免疫进化，亲和力低，极大限制了抗体的临床应用，因此，抗体体外亲和力成熟研究就成为人们关注的热点，本文对基因工程抗体亲和力成熟的研究进展进行综述。

1 抗体体内亲和力成熟

在机体体液免疫系统中，B 淋巴细胞应对抗原刺激诱导抗体产生，并在反复暴露于抗原的过程中，产生高亲和力的抗体，这涉及两个相互关联的过程：首先在骨髓内编码抗体轻重链的胚系基因片段经 V-(D)-J 随机重排产生超过106的组合，这是抗体特异性免疫反应的分子基础；其次，机体接受抗原刺激后，在二级淋巴器官的生发中心，抗体基因尤其是互补决定区（complementarity determining region，CDR）发生高频突变，突变导致抗体结合特性改变。经过滤泡树突状细胞提呈抗原，只有与抗原亲和力最高的 B 细胞将选择生存进一步分化为浆细胞和记忆细胞。近期研究表明，活化的胞嘧啶核苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）将胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，突变后的尿嘧啶引发错配和碱基剪切并引发 DNA 修复，而不正确修复进一步加剧突变产生，导致抗体基因高频突变诱发高亲和力抗体产生[2-5]。目前以 AID 诱发高频突变为基础的哺乳动物细胞展示技术已经成功应用于抗体体外亲和力成熟。

2 基因工程抗体体外亲和力成熟

抗体体外亲和力成熟主要是模拟体内亲和力成熟过程，采取各种策略对抗体基因进行相应突变，构建突变抗体库，通过亲和筛选获得高亲和力抗体。在基因工程抗体体外亲和力成熟的过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前突变策略可分为三大类，随机突变、置换和定向突变。近期研究中抗体体外亲和力成熟的策略仍以随机突变、置换和热点区突变为主，但基于结构实现抗体亲和力提升的报道也越来越多。

2.1 易错 PCR

易错 PCR 指在采用聚合酶对目的基因扩增时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮 PCR 反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。Groves 等[6]采用易错 PCR 结合核糖体展示技术，成功将来源于噬菌体抗体库的抗牛胰岛素抗体亲和力由 5.8 nmol/L 提升至21 pmol/L。Pavoni 等[7]针对一株肿瘤相关抗原 CEA 单克隆抗体采用易错 PCR 诱导抗体轻重链基因突变，构建噬菌体抗体库，成功将抗体亲和力提升 10倍，达到 nmol/L 水平。Wang 等[8]对 HCV E2 糖蛋白中和抗体 HC-1 采用易错 PCR 对抗体轻重链基因随机突变，通过酵母文库使抗体亲和力提升 92 倍，其抗病毒中和活性相应提升 30 倍。

2.2 链置换

链置换通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。因抗体重链在抗结合活性和结构方面的重要性，链置换策略常采用轻链替换，尽量避免链替换后抗体结合特异性发生变化。Lou 等[9]分别在肉毒杆菌毒素 A、B 型特异性抗体的基础上，采用酵母展示技术构建轻链置换库，成功将抗体亲和力提升 9倍和 77 倍，其亲和力提升归因于抗原抗体复合物解离速率的降低。Hur 等[10]为便于构建链置换库，采用双质粒系统分别对抗体轻重链构建噬菌体文库，在初筛抗体的基础上构建人源大容量非免疫轻链库，成功将一株抗IL-15 抗体亲和力提升 36 倍。Brockmann 等[11]在合成抗体库初筛选抗溶菌酶抗体的基础上，构建库容为 7 × 108的轻链置换库，将抗体亲和力提升近 20 倍，达到 0.8 nmol/L。链置换策略的关键是置换文库库容大小，只有置换链基因有足够的多样性，才能为抗体提供适宜的、高亲和力的配伍链。

2.3 CDR 区定向突变

体细胞高频突变并非完全随机，而倾向于发生在与抗原接触的互补决定区，尤其是CDR3 作为抗原结合的核心部位是抗体突变最频发的区段。Steidl 等[12]对一株粒细胞集落刺激因子抗体的重链 CDR2 区和轻链 CDR3 区依次随机替换，经噬菌体抗体库筛选获得亲和力成熟抗体，通过合理组合有效突变将抗体亲和力提升 5000 倍，达到 7 pmol/L。Lowe 等[13]对 IL-15 细胞因子抗体通过轻重链 CDR3 区定向诱导突变，经过噬菌体抗体库亲和筛选，获得抗体DISC0280 使亲和力提升 228 倍，细胞功能活性提升 4000倍，晶体结构显示突变后重链 CDR3 区 6 个氨基酸在结合位点形成一个 α 螺旋。Yoon 等[14]对肿瘤相关糖蛋白TAG-72 人源化抗体 AKA 重链 CDR3 区域引入随机突变，采用噬菌体抗体库亲和筛选，获得抗体 3E8 的亲和力提升 22 倍，并保持原有结合特异性，为肿瘤诊断和治疗提供有效手段。进一步研究发现在编码可变区的基因中存在一些位点频繁突变，而在突变后高亲和力抗体中，这些位点数目往往会下降，称之为热点（hotspot）[15]。Muller 等[16]对一株前列腺特异抗原的 scFv 抗体采用 CDR 热点区突变的方法，对抗体轻链 CDR1 和重链 CDR1-3 区域内热点区随机突变，然后通过有效突变合理组合，最终使抗体亲和力提升 8.5 倍。

2.4 哺乳动物细胞高频突变

哺乳动物展示技术受限于库容，难以产生足够的多样性用于筛选目的抗体。Seo 等[17]将哺乳动物细胞展示技术与体外细胞高频突变相结合，开发出一种新基因工程抗体制备方法，并成功应用于人源抗体的亲和力成熟。在人体内体细胞高频突变依赖于胞嘧啶核苷脱氨酶，它作用于 B 细胞抗体可变区的 DNA 序列，介导热点区胞嘧啶脱氨反应进而诱发高频突变。研究表明高频突变效应可以通过在体外淋巴细胞和非 B 淋巴细胞中引入重组的 AID 实现，Bower 等[18]在 HEK293T 细胞中同时引入抗体基因和 AID，通过 AID介导的脱氨作用实现抗体基因高频突变，模拟体内亲和力成熟过程，结合流式细胞术分选，成功将一株抗神经细胞生长因子抗体亲和力提升至 pmol/L 级。Cumbers 等[19]采用鸡B 淋巴细胞系 DT40 在体外培养过程中通过 AID 效应诱导高频突变，突变累计形成一个抗体库，通过亲和筛选可获得亲和力成熟的抗体。在此基础上构建 DT40-SW 细胞系优化系统，通过引入外源性雌激素衍生物 4-OHT 可选择性启动和终止 AID 依赖的突变效应，并通过部分破坏细胞XRCC3 基因的 DNA 损伤修复作用，增强有益于抗体亲和力成熟的点突变频率[20]。Kajita 等[21]采用 DT40-SW 系统成功将一株抗硝基苯胺单克隆抗体的亲和力提升 600 倍。哺乳动物细胞体外高频突变技术的出现克服了哺乳动物展示技术的很多限制，在最大程度上接近体内抗体亲和力成熟过程，实现了在全人源、分泌型 IgG 抗体的直接筛选和功能改进，在基因工程抗体研发中具有极大的应用前景。

2.5 基于三维结构的抗体亲和力成熟

随着结构生物学的发展，基于结构的药物设计是目前新药研发的热点领域。但由于蛋白结构和功能的复杂性，基于结构的功能改进一直是人们关注的焦点。随着大量抗原抗体复合物晶体结构的解析，人们对抗原抗体间相互作用的理解不断加深，基于结构提升抗体亲和力的成功报道也日益增多。从形态学上来说，当抗体结合不同抗原时，抗体 CDR 结构上也各有特点。当抗原为大分子蛋白时，抗体 CDR 区呈扁平状，与抗原接触区域较大；与半抗原结合时，抗体 CDR区呈现特异性较深的凹陷区；与多肽结合时，抗体 CDR 区呈特异性凹陷的小沟状。Clark 等[22]在一株已具有高亲和力抗整合素 VLA1 抗体晶体结构的基础上，从抗体氨基酸骨架微调、侧链重新装配、静电作用优化三个方面选择突变位点，结果从 80 个抗体突变克隆中发现 10 个突变位点提升抗体亲和力，然后通过突变位点组合获得一株融合 4 个突变位点的抗体，其亲和力达到 850 pmol/L。结构显示突变使抗体骨架发生微调，增强结构灵活性，与抗原互补性更趋完善，同时突变引入的氢键作用也参与提升亲和力。

理想状态下，高精度的复合物晶体结构能够直观显示抗原抗体间相互作用，从而选择突变方法和突变位点进行亲和力改造。因受限于高精度抗原抗体复合物晶体结构，计算机模拟进行辅助设计成为人们研究的热点。Barderas 等[23]采用 CDR 步移法对一株人源抗胃泌素 scFv 抗体 TA4 初步优化后，使抗体亲和力提升 15 ～ 35 倍，然后通过计算机模拟抗原抗体结合构象，分析结合位点的相互作用以选择氨基酸定点突变，最终将抗体亲和力提升 454倍。结构显示轻链 CDR3 区 96 位脯氨酸突变在抗体亲和力成熟中尤为重要，其突变可能增加抗体 CDR 区与抗原的结构互补性。

抗原抗体间相互作用为基于三维结构进行抗体亲和力改造提供线索，同时，亲和力成熟成功案例也加深人们对抗原抗体相互作用的认识。经过亲和力成熟的抗体与祖系抗体在三维结构上的差异可以很好地解释亲和力提升的分子机制。Cauerhff 等[24]在解析鼠单克隆抗体 D44.1 及突变体F10.6.6 与溶菌酶复合物三维结构的基础上，发现抗体亲和力提升并不是通过形成额外的氢键和范德华力，也不是抗原抗体结合面积的增加，而是通过抗原结合区域发生结构微调，使之在结构互补性方面更适应抗原表位，缩短了抗原抗体相互作用间的距离而增强非极性作用。另外，突变体晶体结构发现抗原抗体接触区域互补性的提升同样允许水分子位于接触区域，而水分子的存在为抗原抗体间的氢键搭建了桥梁。近期一项高精度抗原抗体复合物结构表明少量水分子存在于抗原抗体接触界面，与抗原抗体形成氢键。水分子填充了抗原抗体接触表面的空隙，增强结合能量 1 ～ 2 kcal （1 kcal = 4.1868 kJ）。Zahnd 等[25]报道晶体结构也显示改进抗体的点突变均未与配体形成直接相互作用，表明抗体骨架结构的微小改变或者侧链分子间相互作用可提升抗原抗体结合能力。因此，基于晶体结构的分子改进和分子间相互作用分析，两者相辅相成，互相促进发展，已成为基因工程抗体亲和力成熟的重要手段。

2.6 组合策略

为使抗体亲和力成熟达到最好效果，人们可根据抗体特性采用多种突变策略组合，各种基于不同原理的突变策略组合可对基因工程抗体的亲和力成熟产生协同增强效应。Luginbühl 等[26]通过对一朊病毒线性多肽抗体采用易错PCR 和 DNA 重组相结合的突变策略，采用核糖体展示技术成功将亲和力提升至 1 pmol/L，晶体结构显示抗体的轻链 Asn39Asp和重链 Gly107Ala 突变为亲和力提升提供了新的离子键和疏水作用。Kobayashi 等[27]在一株针对雌二醇E2 的 scFv-E4 基础上，先在抗体重链 CDR2-3 和轻链CDR1-3 区采用 CDR 重组使抗体亲和力提升 5 倍；继而在抗体轻重链区采用易错 PCR 使抗体亲和力提升近3 倍。Barderas 等[23]采用 CDR 步移法和基于计算机模拟的分子设计对一株人源抗胃泌素 scFv 抗体 TA4 优化，使抗体亲和力提升 454 倍。

3 抗体库展示技术

各种突变策略需依赖适当的抗体展示技术才可实现抗体的体外亲和力成熟，目前应用成熟的基因工程抗体展示技术包括噬菌体展示、酵母菌展示、核糖体展示以及哺乳动物展示。噬菌体展示技术作为最经典的展示技术，在易错PCR、置换和定向突变策略中成功使大量基因工程抗体实现了亲和力的提升。核糖体展示技术是一种细胞外展示系统，无细胞转化过程，克服转染效率和蛋白表达因素的限制，因此容易构建大库容量的抗体库（＞ 1012）。酵母展示技术中酵母系统作为真核生物，具有翻译后修饰所需的细胞器和酶，可正确折叠表达抗体，且蛋白表达水平偏差小，克服了菌体展示技术中蛋白表达及修饰存在偏差的问题。各种抗体库展示技术各有优劣，均可以应用于抗体体外亲和力成熟的研究，在实际应用时需根据抗体特性和突变策略选择不同的展示技术。

4 治疗性抗体亲和力成熟的应用

治疗性抗体药物因其广阔的市场前景使得此类药物研发和改进成为人们研究的热点，CDR 区定点突变、易错PCR 和基于结构设计等多种策略均成功用于治疗性抗体的亲和力改进。palivizumab 作为 FDA 批准的呼吸道合胞病毒治疗抗体，在少数人群中难以产生保护作用，并难以有效抑制病毒在上呼吸道复制，通过在抗体轻重链 6 个 CDR区定向引入突变，组合有效突变使抗体亲和力提升 1000 倍以上，抗病毒中和活性提升 44 倍，但突变抗体产生的非特异性结合也导致其在动物实验保护活性仅提高 2 倍，在去除导致非特异性结合的氨基酸突变的基础上获得的单克隆抗体motavizumab 亲和力提升 70 倍，中和活性提升20 倍，在体外动物实验中抑制病毒活性增强 100 倍[28-29]。Chen 等[30]在基于针对血管内皮生长因子的治疗性单克隆抗体bevacizumab 的基础上，采用 CDR 区突变策略引入6 个氨基酸突变，开发出亲和力成熟的单克隆抗体药物ranibizumab，使抗体与血管内皮生长因子的结合活性提升100 倍以上。FDA 批准的治疗性抗体cetuximab 通过结合表皮生长因子受体阻断配体结合发挥效应，Lippow 等[31]基于计算机辅助设计结合体外定点突变使抗体亲和力提升10 倍，达到 52 pmol/L。

5 结语

随着基因工程抗体亲和力成熟研究的不断深入，人们对抗原抗体相互作用的认识也更加深入。X 射线晶体衍射技术研究抗体亲和力成熟的过程提示抗体亲和力成熟过程中并没有抗原抗体结合面积的增加，而可能通过氨基酸调整使得抗原和抗体的结合互补性更趋完善；热动力学研究认为体外抗体亲和力成熟多归于抗原抗体复合物解离速率的降低[9]，这些认识为抗体亲和力成熟策略提供理论支持和选择依据。抗体作为药物蛋白已经成为生物行业的新兴产业和重要支柱，基因工程抗体在基因和蛋白水平上进行功能改进，除提升抗体亲和力较关键外，抗体的结合特异性、稳定性和体内代谢动力学特性也需统筹兼顾，综合提高抗体在诊断和治疗应用中的效能。总之，随着体外抗体亲和力成熟突变策略不断完善，尤其是基于结构的分子设计和哺乳动物细胞展示结合高频突变技术研究不断发展，将更加广泛地应用并促进抗体产业的发展。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.007

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

2012-04-28