黏菌素HPLC分析方法的研究进展

陈 曦 王观悦 徐宗香 安丽娜 李 阳

（黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006）

黏菌素HPLC分析方法的研究进展

陈 曦 王观悦 徐宗香 安丽娜 李 阳

（黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006）

黏菌素是一类对革兰氏阴性致病菌具有很强体外抗性的多肽抗生素，能治疗由多重耐药性病菌引起的多种疾病。黏菌素的分析方法主要有微生物学方法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫分析法（ELISA）、毛细管电泳法（CE）及薄层层析法（TLC）等。本文主要综述黏菌素的高效液相色谱（HPLC）分析方法的研究进展。

多黏菌素 分析方法 高效液相色谱法

黏菌素（colistin）是1947年从多黏菌素B.polymyxa 或产气孢子杆菌B.aerobaillus 的培养滤液中得到的一种碱性多肽类抗生素。黏菌素又称为多黏菌素E，黏杆菌素，克利斯汀和抗敌素，它是一种至少含有30多种不同成分的混合物，主要为黏菌素A和黏菌素B[1]。黏菌素是一种抗菌作用较强、毒性较低的多肽类抗生素，它对革兰阴性菌具有强大抗菌作用，并能中和革兰阴性菌产生的内毒素，且具有残留低，不易产生耐药性等优点，因此，黏菌素是最有发展前途的抗菌素之一。

黏菌素是由七环和末端的三肽组成的十肽菌素，尾部的脂肪酸通过酰胺键连接到末端的三肽，七环有亲水端和疏水端，三肽只有亲水端。带有正电荷的氨基酸和尾部的脂肪酸使黏菌素具有兼容性，可溶于水，也可溶于脂类[2]。黏菌素为白色结晶或结晶性粉末，干燥状态下可长期保持稳定。临床上主要是用其硫酸盐，硫酸黏菌素为白色或微黄色粉末，微臭或几乎无臭，味苦，有吸湿性，易容于水和含水甲醇。英国药典解释为不溶于乙醚、丙酮和氯仿，美国药典解释为微溶于甲醇，不溶于乙醚和氯仿。硫酸黏菌素的水溶液呈左旋性，性能稳定，可在 100 ℃下保存9 d，在 40℃下保存 60 d，活力不变。在 pH 值为3～7.5 较稳定，在强酸性及碱性溶液中易分解，与茚三酮及双缩脲呈阳性反应。耐热，消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，无副作用，不易产生耐药菌株[3]。硫酸黏菌素结构中不存在发色团，需衍生化后能用LC法测定。

目前国内对硫酸黏菌素的研究主要集中在应用以及动物性食品中残留检测方法上，对其毒性及药物代谢方面也有一些初步研究。黏菌素分析方法主要有微生物学方法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫分析法（ELISA）、毛细管电泳法（CE）及薄层层析法（TLC）等。Leroy等[4]（1989）运用微生物学方法和HPLC法检测了小牛体内黏菌素的含量，结果显示微生物学方法缺乏敏感性，选择性和检测时间偏长（21h），而HPLC法非常灵敏，能够分离黏菌素各组分。由于免疫原准备工作很复杂，所以很少有研究是应用酶联免疫分析法进行黏菌素的残留检测。

微生物学方法和酶联免疫分析法均不能分离黏菌素各组分，而薄层层析法（TLC）、毛细管电泳（CE）和高效液相色谱法（HPLC）能分离黏菌素（碱和硫酸盐）A和B，但是不能与甲烷磺酸黏菌素区别开来，所以关于黏菌素的体内分析方法国内还存在着一些缺陷。

高效液相色谱法自上世纪70年代初应用于分析黏菌素以来，主要用于对黏菌素所含各组分的分离。Shigeru Terabe等[5]（1979）、T.J.Whall[6]（1980）、Cindy Govaerts[7]（2002）等相继对此进行了报道，分离出的成分多达十三种。也有资料报道用HPLC法测定硫酸粘杆菌素的含量，其检测限较高，最低为0.5μg/ml。

黏菌素主成分结构中具有多个伯胺基团，能与C18填料中残留的硅醇基发生强烈相互作用，导致峰拖尾或峰形异常，所以流动相一般呈酸性，需含有高浓度的盐或隐蔽剂以抑制硅醇基的吸附活性。Ikai[8]的研究结果表明：大孔径填料和不含硅醇基的苯基填料对分离效果较好，峰形尖锐。大孔径填料可能有利于高分子量黏菌素的自由扩散，传质阻力较小。

解庆缤等[9]（1988）侧洗脱液为乙晴，磷酸/甲酸盐和乙酸盐缓冲液，C18柱以23%的乙晴磷酸盐缓冲液为流动相，紫外检侧，在1.0～100.0μg范围内浓度呈良好的线性关系。检测限为5×10-7g，A、B的回收率分别为98.O%和97.1%。

Decolin等[10]（1997）测定牛组织（肌肉、肝脏、脂肪）及牛奶中粘杆菌素的残留，10%（w/v）三氯乙酸为蛋白沉淀剂，在C18柱上固相纯化，柱前洗脱液为乙晴：磷酸盐缓冲液（pH7.0）65：35（V/V），分析柱洗脱液为68：32（V/V），荧光检测，激发波长及发射波长分别为340nm和440nm。黏菌素A、B保留时间分别为14min、18min。黏菌素结构用HPLC法联合质谱进行分析。结果表明：在10～500mg/L（牛奶）、50～1000mg/kg（肌肉、脂肪）、100～1000mg/kg（肾脏、肝脏）范围内的标准曲线相关系数大于0.990。在25 mg/L（牛奶）、100 mg/kg（组织）标准浓度相对偏差值低于10%（6个重复），回收率高于60%。

选择适当检测波长对成功建立测定方法相当关键，HPLC/UVD（200～254nm）由于组织中干扰黏菌素检测的物质较多，其灵敏度和选择性较难满足黏菌素残留分析要求，HPLC法分析中的进行衍生化反应可以提高检测分析的灵敏度和选择性。在室温碱性条件下（pHl0.0）和2-疏基乙醇存在下，黏菌素结构中伯胺基团迅速与邻二苯甲醉（OPA）发生缩合反应，生成具有强烈荧光，较稳定的l-S-烷基-2-N-烷基异吲哚衍生物。

黏菌素呈弱碱性，易溶于水，在酸性溶液中较稳定.Ikai[8]（1995）报道黏菌素的C18净化方法，平衡：甲醇，水；洗涤：水，15%乙晴（含0.1%TFA）；洗脱：乙晴—0.017mol/LTFA（20+80），上述C18洗涤液对除去杂质很有效，回收率为64%，检测限为0.2μg/g，该方法较低的回收率可能与待测物吸附和提取过程中基质的共沉淀有关。

Decolin等[10]（1997）建立的黏菌素衍生化LC/FLD方法中，组织样品（牛肌肉，肝，肾，脂肪）的提取溶剂为甲醇-10%TCA（50+50），提取乳汁则仅使用10%TCA，提取液经甲醇—0.01mol/LHCL（55+45）洗脱，OPA试剂衍生化，在线Cl8柱净化后测定，回收率62%～78%，检测限为0.002（乳）～0.02（组织）μg/g.黏菌素与组织结合较强，提取液中加入TCA可沉淀蛋白质和解离药物，固体样本需同时加入甲醇以改善提取效率。Li等[11]（2001）运用一种简便、快速、灵敏的HPLC方法检测血浆中的黏菌素（碱或硫酸盐），即先运用荧光性的芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）进行柱后衍生化，再采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离分析血浆中的黏菌素。通过此种方法，在检测黏菌素的过程中就能排除通过此种方法，在检测黏菌素的过程中就能排除甲烷磺酸衍生物的干扰，并且与运用邻苯二甲醛（OPA）进行衍生化不同的是这些添加了FMOC的衍生物在室温下可保持3d，而且此法能分离黏菌素A和黏菌素B。

高效液相色谱法具有很高的特异性、灵敏度以及较快的检测速度，但由于硫酸粘杆菌素组成的多样性及成分的不确定性，使得应用高效液相色谱法对其进行残留分析还有待进一步的研究。

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