子宫肌瘤患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义

苑桂娟

子宫肌瘤患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义

苑桂娟

目的探讨外周血单核细胞(PBMC)中DcR3基因表达水平与子宫肌瘤的关系。方法65名子宫肌瘤患者和62名健康对照者各取5ml静脉血，肝素抗凝，密度梯度离心法分离PBMC，TRIZOL法提取PBMC总RNA，用半定量RT-PCR法检测PBMC中DcR3基因的相对表达水平，并用t检验进行比较。结果子宫肌瘤患者组PBMC中DcR3基因的相对表达水平为(0.845±0.029)，与正常对照组(0.140±0.003)相比有明显差异(P＜0.01)。结论子宫肌瘤患者PBMC中DcR3基因的表达水平增高。

DcR3；基因表达；子宫肌瘤；外周血单核细胞

子宫肌瘤的发病机制尚未完全阐明，但近年来发现肌瘤与凋亡等信号转导途径的紊乱有关，在子宫肌瘤患者的病理组织上发现多种抗凋亡基因的过度表达[1]。新近发现一个可溶性受体蛋白—诱惑受体3(decoy receptor3)能竞争性地与FasL结合，从而阻断FasL诱导的凋亡，在多种肿瘤、增生性疾病中发挥着重要的作用[2]。凋亡途径的中断导致细胞不能正常凋亡，而不断增生，最终发生子宫肌瘤。本实验采用RT-PCR法检测DcR3基因在子宫肌瘤患者及健康人外周血单核细胞(PBMC)中的表达，以探讨其表达与子宫肌瘤的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

Oligod(T)、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、细胞分离液等购自Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。凝胶电泳成像分析系统TannonGIS1000(Tannon有限公司，上海)，PCR仪FeroTec(杭州PCR仪有限公司)。

1.2 研究对象

子宫肌瘤患者65例，年龄35～65岁。全部病人均经妇科彩超检查术后病理确诊，且未经治疗。健康对照组62例，年龄30～64岁。

1.3 实验方法

1.3.1 PBMC分离

研究对象各取静脉血5ml，肝素抗凝，加入含5ml淋巴细胞分离液的离心管中，离心2000r/min，20min，可见血浆与分离液的界面上有一白膜层，此即所需的PBMC。吸出细胞至另一试管用生理盐水洗3遍，离心2000r/min，5min，弃上清。

1.3.2 RNA的提取及RT-PCR

在上述PBMC标本中加入变性裂解液Trizol1ml吹打使细胞充分溶解,置室温5min后加入氯仿200μ l，剧烈震荡15s，室温5min，4℃12000r/min离心15min，取上清加入等体积的异丙醇，混匀后-20℃1h，4℃12000r/min离心10 min，弃上清，加入75%乙醇1ml，4℃7500r/min离心5min,吸去乙醇自然干燥10～20min,溶于10μlDEPC水中。此即人外周血总RNA。在上步得到的10μl模板RNA中，加入1μlDEPC水，1μl引物Oligod(T)，稍离心，100℃沸水1min；加入2μldNTP，4μl5×buffer，2μlAMV逆转录酶，稍离心，42℃水浴90min；沸水3min，灭活AMV，得到总cDNA。

聚合酶链反应PCR扩增DcR3基因(214bp)和β -actin基因(570bp)。引物序列：DcR3基因引物正义链为5′-TCAATGGCCAGGCTCTTC-3′,反义链为5′-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3′；β-actin基因引物正义链为5′-TGACGGGGTCACCCACACT GTGCCCATCTA-3′。反义链为5′-CTAGAAGC ATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG-3′。

1.3.3 PCR产物的相对定量分析

5μlPCR产物经1.5%的普通琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙啶染色,通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析，把DcR3/β2actin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。

1.4 统计学处理

2 结果

结果显示，健康对照组和子宫肌瘤患者PBMC中均检测到DcR3基因的表达，PCR产物电泳后在214bp大小位置均见有一清亮条带，与预计的DcR3基因片段大小一致，同时在570bp大小位置也显示有清亮条带，此为内参照基因β-actin片段产物。DNA条带和强度分析示，正常人PBMC中DcR3基因有低水平的表达，其相对表达水平为（0.140± 0.003）；但子宫肌瘤患者PBMC中DcR3基因呈过度表达，其相对表达水平（0.845±0.029）。两者相比有明显差异(P=0.012)。

3 讨论

本实验对65例经妇科彩超和病理诊断的子宫肌瘤患者和62例健康人进行了PBMC中DcR3基因检测，发现子宫肌瘤患者血中DcR3基因表达明显高于正常人群，说明DcR3基因异常表达与子宫肌瘤有一定的关系。

子宫肌瘤的发病机制尚未完全阐明，但近年来发现肌瘤与凋亡等信号转导途径的紊乱有关，在子宫肌瘤患者的病理组织上发现多种抗凋亡基因的过度表达[1]。细胞凋亡是细胞接受某种信号刺激后一种主动性细胞程序性死亡。细胞凋亡的阻断与肿瘤发生发展密切相关。近年来研究发现bcl-2、bax、p53等基因与生长因子和激素共同作用影响子宫肌细胞的生长、分化、增生和凋亡。而诱惑受体3能阻断细胞凋亡途径，在多种肿瘤、增生性疾病中发挥着重要的作用[2]，故可能在子宫肌瘤的发生与发展中起一定的作用。

DcR3是一个含300个氨基酸的蛋白质，分子量为35KD。1998 年Pitti等[2]搜查EST数据库时发现一组与TNFR基因超家族成员有同源性的ESTs，通过重叠序列，从人胚肺中分离出一条新的全长cDNA，并把此cDNA编码的蛋白称DcR3；进一步研究发现DcR3基因在肺癌、结肠癌细胞中高度表达，在外周血单核细胞(PBMC)中也可检测到DcR3基因的表达；Wu等[3]为了探讨血清DcR3对肿瘤的诊断意义，运用ELISA方法检测了数十例肿瘤、急性感染、肝硬化患者及健康对照者血清DcR3水平，结果显示，56.2%肿瘤患者血清DcR3呈阳性。DcR3可通过抗细胞凋亡、降低宿主免疫系统功能以及促使肿瘤血管形成等促进肿瘤的发生发展，运用单克隆抗体与RNA干涉(RNAi)技术有可能从蛋白水平和基因水平阻断DcR3的表达，解除DcR3对肿瘤细胞的凋亡抑制作用、恢复机体正常免疫功能[4]。

有资料表明[5]，DcR3基因在矽肺、肺纤维化、关节炎等患者PBMC中高度表达，提示DcR3过度表达可能在这些疾病的发病过程中发挥重要的影响。本研究表明，子宫肌瘤患者PBMC中DcR3基因的过度表达，与正常人相比有统计学意义，提示高度表达的DcR3可能阻断细胞凋亡，可能与子宫肌瘤的发病有关。李卫平等应用RT-PCR法测定21例肌瘤患者,发现肌瘤组织内bcl-2/bax比值显著高于正常子宫平滑肌[6]。郭昕等用免疫组化ABC法在50例患者中发现了同样的结果[7]。bcl-2基因过度表达抑制了肌瘤细胞的凋亡，使细胞生存时间延长，导致细胞堆积或细胞突变率增加。这些抗凋亡基因的过度表达可能与DcR3阻断凋亡途径有关，所以说DcR3对子宫肌瘤患者的发病机制有一定的贡献。因此可称为子宫肌瘤诊断的标志物或者为治疗子宫肌瘤提供新的靶位。

[1]李小花,归绥琪.子宫肌瘤的分子遗传学研究进展[J].生殖与避孕,2006,26（12）:740-744.

[2]Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer [J].Nature，1998，396 (6712)：699-703.

[3]Wu Y,Han B,Sheng H,etal.Clinical significance of detecting elevated serum DcR3/TR6/M68 in malignant tumor patients[J].Int J Cancer, 2003,105(5):724-732.

[4]Li H,Zhang L,Lou H,etal.Overexpression of decoy receptor 3 in precancerous lesions and adenocarcinoma of the esophagus[J].Am J Clin Pathol,2005,124(2):282-287.

[5]王秀丽,尹金植,黄志卫,等.特发性肺间质纤维化病人外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义[J].中国老年学杂志,2004,24(12):1129-31.

[6]李卫平,严隽鸿,林其德,等.凋亡调控基因Bcl-2/Bax mRNA在子宫平滑肌瘤中的表达[J].上海第二医科大学学报,2000,20(6):514-7.

[7]郭昕,佟丽波,杜佳秋.细胞凋亡相关基因bcl-2和bax在子宫肌瘤中表达的意义[J].黑龙江医药科学,2004,27(4):55-6.

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