超声-β-CD协同提取橘叶黄酮

李志英，何云飞

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

橘叶为芸香科植物及其栽培变种的干燥叶。橘叶中含有大量具有抗氧化活性的黄酮类物质，是一种潜在的外源性抗氧化剂原料。橘叶中的黄酮类化合物对治疗冠心病、心绞痛、高血压都有显著效果，具有降低血脂，抗菌消炎，抗白血病等多种功效。可有防治由于血管老化和脑血管供血不足所致的疾病[1]。

环糊精（CD）具有疏水性的内腔和亲水性的表面，是超分子化学中的基础物质之一，它具有的包合特性使其在理论和实际应用中得到迅速发展[2]。尤其在医药方面，CD 和CD 衍生物与传统药物载体材料相比，无毒，性质稳定，结构独特，可用于提高药物溶解度和稳定性，增强药物利用率[3]。方法简便，效果明显，便于产品加工。

近年来超声波提取方法作为一种优良的提取方法已经广泛应用于天然植物中有效成分的提取[4]。本实验通过含有β-CD 介质中超声辅助提取橘叶中的黄酮，代替了传统的水浸法，醇提法，有效的提高了橘叶中黄酮的提取效率。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

AL104 电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-2550 紫外可见分光光度计：岛津公司，苏州；HK-1D 型恒温水槽：南京大学应用物理研究所；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

橘叶（购自忻州五台山药房）：自然干燥，粉碎，过60 目筛，备用。芦丁标准品（A.R.北京化学试剂公司）：准确称取芦丁标准品40 mg，用无水乙醇溶解于50 mL小烧杯中，然后用30%的乙醇定容于100 mL 容量瓶中，配制成0.4 mg/mL 芦丁标准液；β-环糊精（A.R.）：天津市光复精细化工研究所）；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 橘叶中黄酮的提取方法

称取处理好的橘叶粉末1.000 0 g 置于50 mL 圆底烧瓶中，加入0.100 0 g β-CD，40%的乙醇30 mL，在温度60 ℃，功率50%，超声提取4 min，用40%的乙醇定容到50 mL 容量瓶，离心，备用。

1.2.2 橘叶中黄酮的测定方法

精确吸取提取液2 mL 于25 mL 比色管中，加入30%的乙醇5.0 mL 后，再加入5%亚硝酸钠1 mL 静置6 min，继续加入10%硝酸铝1 mL 静置6 min。然后加入4 %氢氧化钠5 mL，用30 %的乙醇定容后放置10 min。在510 nm 处以试剂空白为参比测量其吸光度。实验确定回归方程为：A=0.010 7c+0.062 8（g/mL），相关系数R2=0.999 6，按此方程求得提取液中黄酮的质量，按下式计算黄酮的提取率：

黄酮提取率的计算公式：

2 结果与讨论

2.1 吸收波长的测定

取25 mL 的两支比色管，一支加入0.4 mg/mL 的芦丁标准液1 mL，另一支加入提取液1 mL，按1.2.2 的实验方法，以试剂空白为参比，在紫外可见分光光度计下测定其吸收光谱，结果见图1。

图1 芦丁及提取液的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of rutin and extract

由图1 知，芦丁的最大吸收波长为510 nm，在β-CD 存在下，吸收光谱紫移16 nm，吸光度增加了3 倍，光谱的变化说明β-CD 在黄酮提取中和黄酮发生了作用[6]。吸光度的变化说明提取率的增加。

2.2 单因素实验

2.2.1 不同介质下橘叶黄酮提取率的影响

称取处理好的1.000 0 g 橘叶3 份置于3 个50 mL容量瓶中。其它条件不变，改变介质为20 mL40%的乙醇，0.100 0 gβ-CD，0.100 0 g 羟丙基-β-CD，按1.2 的实验方法测定以上3 种提取液的提取率。结果如表1。

表1 不同提取介质中提取率Table 1 Result of different medium

由表1 知，在相同条件下，比较3 种介质下超声辅助提取橘叶中的黄酮的提取效果，β-CD 溶液中提取效果最好，其原因可能是β-CD 和黄酮类化合物形成包和物，增加了黄酮类物质的溶解度，因此，本研究选择β-CD 为提取介质。

2.2.2 β-CD 用量的选择

准确称取1.000 0 g 橘叶粉末，其它条件不变，只改变β-CD 的量，m（橘叶）：m（β-CD）为1∶0.2，1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1 得提取液。按1.2.2 的实验方法，测其吸光度，结果见图2。

图2 β-CD 的用量的影响Fig.2 Effect of β-CD on extraction rate

由图2 可知，随着加入β-CD 的量不断增加，黄酮得率先增大后降低之后又增大，总体看来β-CD 的量对黄铜提取率影响不大，考虑其节能方面及提取率，取最佳β-CD 量为m（橘叶）：m（β-CD）=1：0.2。

2.2.3 超声提取时间的选择

准确称取1.000 0 g 橘叶粉末，其它条件不变，改变提取时间为2、4、6、8、10 min，按1.2.1 的实验方法提取，按1.2.2 的实验方法测其吸光度。结果见图3。

图3 超声温度对提取率的影响Fig.3 Effect of time on extraction rate

由图3 知，随着超声提取时间的增大，提取率先增大后减小。原因可能是由于提取时间过长，部分黄酮分解等原因造成[7]。选4 min 为最优超声提取时间。

2.2.4 超声提取功率的影响

准确称取1.000 0 g 橘叶粉末，其它条件不变，改变超声功率：40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %，按1.2.1 的实验方法提取，按1.2.2 的实验方法测其吸光度。结果见图4。

图4 超声功率对提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate

由图4 知随着超声提取功率的增大，橘叶中黄酮得率先增大后降低，功率为90%时又稍增大。考虑其节能方面及提取率，故取50%为最优超声提取功率。

2.2.5 超声温度对提取率的影响

准确称取1.000 0 g 橘叶粉末，其它条件不变，改变提取温度为40、50、55、60、65、70 ℃。按1.2.1 的实验方法提取，按1.2.2 的实验方法测其吸光度。结果见图5。

图5 超声温度对提取率的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

由图5 知随着超声温度的升高提取率先增大后减小。可能由于温度太高部分黄酮分解等原因造成[8]。综合考虑其影响，选取60 ℃为最佳超声温度。

2.2.6 料液比对提取率的影响

准确称取1.000 0 g 橘叶粉末，其它条件不变，设置不同料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g/mL）得提取液。按1.2.2 的实验方法测其吸光度。结果见图6。

图6 料液比对提取率的影响Fig.6 Effect of solid to liquid ratio on extraction rate

由图6 知随着料液比的增大，提取率逐渐降低。综合考虑其影响，选取1∶30（g/mL）为最佳料液比。实验用20%、30%、40%、50%、60%的乙醇为提取溶剂，按1.2 的实验方法提取并测定，结果表明：40%的乙醇为最佳提取溶剂。

2.3 正交试验

根据以上单因素试验结果，由于β-CD 量影响不大。故选出影响黄酮提取得率的4 因素：超声温度，料液比，超声提取功率，超声提取时间进行优化组合，以所测得吸光度为查考指标，采用L9（34）进行正交试验，优选出超声辅助β-CD 水溶液提取法提取橘叶中黄酮的最佳工艺参数。

表2 L9（34）正交试验结果Table 2 L9（34）Results of orthogonal experiments

由极差分析可知，各因素对黄酮类化合物提取影响因素大小为：A（超声温度）＞C（超声提取功率）＞B（料液比）＞D（超声提取时间）。故最佳试验方案是：A2B1C2D3，即超声提取时间为6 min，提取功率为50%，料液比为1∶30（g/mL），超声温度60 ℃。计算在此条件下的黄酮提取率为：6.67%。

2.4 对比实验与验证实验

称取1.000 g 橘叶样品3 份，在料液比为1 ∶30（g/mL），超声与加热温度均为60 ℃，分别用40%的乙醇浸取，40%的乙醇超声提取，加β-环糊精的40%乙醇溶液超声提取，分别做三次平行实验，结果见表3。

由表3 可知，在相同提取条件下，β-环糊精的40%乙醇溶液超声提取率大于40%的乙醇超声提取率大于40%的乙醇提取率，说明β-环糊精能有效增加黄酮类物质在水中的溶解度。

表3 对比实验Table 3 Compaison of experiments

最佳工艺条件下黄酮的提取率为6.67%，与单因素测定值基本相符，证实了该方法的准确性和实用性。在此条件下提取3 次，黄酮的提取率见表4。

表4 最佳工艺条件及其验证Table 4 Results of validation experiments under optimized extraction conditions

经过三次提取，总提取率为6.67%，与测定值相符。

3 结论

超声技术用于橘叶中黄酮的提取，具有操作简便、产率高等优点。最佳提取条件为用40%的乙醇在料液比1 ∶30（g/mL），m（β-CD 的用量）：m（橘叶）为0.2 ∶1，超声功率50%，超声温度60 ℃，提取4 min，在此工艺条件下提取率为6.67%，与传统方法相比，提取时间缩短了90%，黄酮提取率提高了70%。

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