利用光学成像系统非侵入性监测乳腺癌细胞在骨环境内的生长情况

严伟，金芳纯，范启明，汤亭亭

利用光学成像系统非侵入性监测乳腺癌细胞在骨环境内的生长情况

严伟，金芳纯，范启明，汤亭亭

目的应用稳定表达红色荧光蛋白的人乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 细胞系，建立乳腺癌骨移植瘤动物模型，并应用活体成像技术检测肿瘤的生长情况。

方法注射 MDA-MB-231SArfp 细胞于 BALB/c 雌性裸小鼠胫骨髓腔，应用活体光学成像系统，连续观察肿瘤细胞在体内的生长情况，同时测量肿瘤体积的变化；4 周和 7 周时拍摄 X 线片并做组织学检查，评估肿瘤对骨组织的影响。

结果利用活体光学成像系统监测发现，至第 3 ～ 4 周期间，肿瘤进入对数生长期；肿瘤大小与荧光信号强度呈线性正相关。X 线片和组织切片显示 MDA-MB-231SArfp 细胞形成溶骨性的骨破坏。

结论成功建立了可非侵入性监测的乳腺癌骨移植瘤模型，利用活体光学成像系统结合 X线片及组织学检查能够直观、连续、准确地检测肿瘤细胞在骨环境内的生长情况，为后续抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。

乳腺肿瘤； 疾病模型，动物； 诊断显像；荧光 X 线摄影术

与生物发光技术相比，荧光成像技术具有标记靶点的多样性、一次可以应用不同的荧光基因标记不同的细胞的优势，因而在分子生物学研究和观察小分子体内代谢（如肿瘤细胞、免疫相关细胞）等方面已经广泛应用。目前常用的荧光基团以表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）为代表，无需底物即可自发荧光，对细胞几乎无毒性。

本实验利用稳定表达红色荧光蛋白（RFP）的人乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 细胞系，通过裸鼠胫骨髓腔注射，建立乳腺癌骨移植瘤动物模型，利用活体荧光成像技术对此模型内的肿瘤生长进行非侵入性的连续监测，同时进行 X 线片、组织切片的检查，发现乳腺癌细胞在骨环境内的生长规律，为后续在动物体内进行抗乳腺癌骨转移药物研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及培养 RFP 标记的乳腺癌细胞系MDA-MB-231SArfp 获赠于澳大利亚西澳大学Jiake Xu 教授，此细胞系是从乳腺癌骨转移灶中分离的细胞，具有骨转移的特性[15]。常规培养于含10% 胎牛血清和 G-418（0.75 mg/ml，用于筛选稳定表达 RFP 的细胞[16]）的 DMEM 培养液（美国HyClone 公司产品）中，置于 CO2体积分数为 5%、37 ℃ 饱和湿度的培养箱中培养传代。

1.1.2 实验动物及分组 4 ～ 5 周龄 BALB/c 雌性裸鼠 20 只，体重约 20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，均饲养于无特定病原体的环境下。10 只用于活体荧光成像检测，并记录生存曲线；另外 5 只于注射肿瘤细胞 4 周后处死，拍摄X 线片并做组织学检测，剩余 5 只于注射肿瘤细胞 7 周后处死，拍摄 X 线片并做组织学检测。

1.1.3 仪器 小动物活体成像仪为美国 Xenogen公司的 IVIS spectrum。

1.2 方法

1.2.1 荧光显微镜下观察 MDA-MB-231SArfp细胞的 RFP 表达 取对数生长期的 MDA-MB-231SArfp 细胞，置于荧光显微镜下，观察其红色荧光蛋白表达的情况。

1.2.2 活体成像系统检测 MDA-MB-231SArfp 细胞的荧光表达 用 PBS 缓冲液将 MDA-MB-231SArfp 细胞在黑色的 96 孔板中进行倍比稀释，每孔 100 μl，细胞数从 10 000/孔到 78/孔，最后一孔用 PBS 作为阴性对照。用活体成像系统检测不同细胞数量的荧光强度，采集并分析数据，绘制细胞数量与荧光强度的量-效关系曲线。

1.2.3 乳腺癌骨移植瘤模型的构建和荧光检测 取对数生长期的 MDA-MB-231SArfp 细胞株以 0.2% 的胰酶消化，用 DMEM 培养液终止消化后，制成细胞悬液，1000 r/min 离心 4 min 后重悬于 PBS 中。用台盼蓝染色测定细胞存活率，发现细胞存活率大于 98%。用 PBS 调整细胞密度为1 × 107/ml；按每只裸鼠 0.1 ml 悬液的剂量注射于20 只 BALB/c 雌性裸小鼠的胫骨髓腔内，随机选取 10 只在 2 h 内检测荧光强度并记录，以后每周进行一次活体荧光检测并记录，同时记录每只裸鼠的死亡时间，绘制生存曲线。

1.2.4 肿瘤体积测量 每周用游标卡尺测量肿瘤长径、短径和厚度，计算移植瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。移植瘤体积按公式：V = 4/3 π（a × b × c）（V 为肿瘤体积；a 为长径/2；b 为短径/2；c 为厚度/2）进行计算。

1.2.5 X 射线片和组织学检查 注射肿瘤细胞4 周后和 7 周后分别对荷瘤裸鼠进行 X 射线检查。移植瘤取下后用 4% 多聚甲醛固定 24 h，流水冲洗过夜，以 10% EDTA 于 4 ℃ 脱钙 3 周后石蜡包埋，做组织切片，HE 染色并观察。

1.3 统计学处理

所有数据使用 SPSS13.0 软件进行处理，计量资料以x±s表示，相关性采用 SPEARMAN 等级相关进行分析，双侧检验水准为 α = 0.05，所有检验以P＜ 0.05 认为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 MDA-MB-231SArfp 细胞的 RFP 表达

RFP 标记的 MDA-MB-231SA 细胞为多边形上皮样细胞，贴壁生长，荧光显微镜观察可见细胞表达的荧光信号较强，荧光较为均匀地分布于整个细胞内，表达率接近 100%，细胞在体外能够稳定表达红色荧光蛋白，并且随体外长期传代培养无明显消褪（图 1）。

2.2 活体荧光成像检测 MDA-MB-231SArfp 细胞的 RFP 体外表达

通过活体荧光成像系统 IVIS 观察不同浓度的 MDA-MB-231SArfp 细胞荧光表达，结果发现，该成像系统能够检测的最小细胞数为 500 ～ 700个肿瘤细胞，仪器灵敏度较高，随着细胞浓度的递增，荧光表达的强度也逐渐增加，即平均荧光量子数与细胞浓度成正比（r2= 0.9449，P＜ 0.05)（图 2）。

图 1 荧光显微镜观察发现 MDA-MB-231SArfp 细胞稳定表达 RFP[A、C 为普通光镜下照片；B、D 为荧光显微镜照片（A、B × 40；C、D × 100）]Figure 1 Fluorescence micrograph incicated that red fluorescence proteins stably expressed in MDA-MB-231SArfp cells.A, C:Bright field; B, D: Fluorescent field (A、B × 40; C、D × 100)

图 2 活体光学成像系统体外检测 MDA-MB-231SArfp 细胞 RFP 表达[A：MDA-MB-231SArfp 细胞倍比稀释检测荧光信号强度；B：细胞荧光强度与细胞数目线性相关（r2 = 0.9449，P ＜ 0.005）]Figure 2 The RFP expression of MDA-MB-231SArfp cells detected by the optical imaging system in vitro [A: In vitro fluorescent intensity of various cell numbers of MDA-MB-231SArfp cells; B: The correlation analysis between cell numbers and fluorescent intensity (r2 = 0.9449, P ＜ 0.005)]

图 3 活体光学成像系统非侵入性监测乳腺癌细胞在骨内的生长情况Figure 3 Non-invasive monitoring of the growth of MDA-MB-231SArfp breast cancer cells in bone using the optical imaging system

2.3 活体荧光成像动态观察 MDA-MB-231SArfp细胞在体内生长情况

注射 MDA-MB-231SArfp 细胞 2 h 内检测，能观察到注射部位的荧光信号。1 周和 2 周后活体荧光成像检测，荧光信号主要集中于肺内，而胫骨部位信号相对较弱，考虑为注射于胫骨髓腔的肿瘤细胞有部分进入血液循环，在肺内有短暂的停留（1 ～ 2 周），肺内环境并非 MDA-MB-231SArfp细胞最适宜生长的“土壤”，最终循环内的肿瘤细胞要么死亡，要么继续循环定植于骨微环境中。在第 3 ～ 4 周期间，肿瘤进入对数生长期，荧光信号较强且稳定集中于腿部，至第 7 周达到高峰，背部和肺内可见散在的荧光信号表达，考虑为转移灶（图 3和图 4A）。

图 4 乳腺癌细胞在体内的生长情况和荷瘤裸鼠生存情况[A：乳腺癌细胞荧光强度变化随时间变化曲线；B：肿瘤体积随时间生长曲线；C：移植瘤体积和荧光强度的相关性分析（r2 = 0.8563，P ＜ 0.005）；D：裸鼠的生存曲线（n = 10）]Figure 4 The growth of breast cancel cells in vivo and survival time of the nude mice bearing the tumor [A: The fluorescent intensity of MDA-MB-231SArfp cells detected by the optical imaging system changed with time; B: The tumor volume changed with time; C: The correlation analysis between tumor volume and fluorescent intensity (r2 = 0.8563, P ＜ 0.005); D: The survival time of the nude mice bearing the tumor (n = 10)]

2.4 肿瘤体积变化情况

3 周时肉眼可见肿瘤，3 ～ 4 周间肿瘤明显生长（图 4B），至第 6 周，6 只动物腿部都出现了不同程度的坏死，第 7 周时游标卡尺测量肿瘤体积可达（9.39 ± 1.15）cm3，相关性分析显示，移植瘤体积与表示活体肿瘤细胞生长情况的荧光量子数成正相关（r2= 0.8563，P＜ 0.05）（图 4C）。第6 周开始，由于肿瘤体积过大以及转移的发生，荷瘤小鼠开始死亡，生存曲线见图 4D。

2.5 X 线片和组织切片观察结果

4 周的 X 线片即可以观察到 MDA-MB-231SArfp 细胞在胫骨造成了溶骨性的骨缺损（图5），和文献[16-17]报道的时间相一致，7 周时胫骨几乎完全破坏吸收。4 周和 7 周的 HE 染色切片在显微镜下都可观察到肿瘤细胞侵袭骨质，造成了骨质破坏（图 5）。

3 讨论

本实验用红色荧光蛋白标记的乳腺癌细胞构建了骨移植瘤裸鼠模型，Yang 等[18]认为红色荧光蛋白有较高的敏感性和分辨率，DsRed 的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，而且DsRed 对 pH 值不敏感，pH 值为 4.5 ～ 12 时仍保持稳定。

图 5 乳腺癌在骨内生长的 X 线片和组织切片观察结果（A ～ C 为未注射肿瘤细胞的正常裸鼠；D ～ F 为注射肿瘤细胞4 周后的观察结果；G ～ I 为注射肿瘤细胞 7 周后的观察结果；B、E、H 为 X 线片，其中白色箭头显示骨缺损位置；C、F、I 为 HE 切片，黑色箭头指示骨组织，红色箭头为肿瘤组织）Figure 5 The radiographic and histological analysis of the growth of breast cancer cells in bone (A - C: Acquired from normal mice without MDA-MB-231SArfp cells inoculation; D - F: Acquired from mice with MDA-MB-231SArfp cells inoculated after 4 weeks ;G - I: Acquired from mice with MDA-MB-231SArfp cells inoculated after 7 weeks; B, E, H are X-ray images with the white arrows indicated the osteolytic lesions; C, F, I are HE staining micrographs from of xenograft in tibia with red arrows indicated the tumor tissue and the black arrows indicated the bone tissue)

实验应用的乳腺癌 MDA-MB-231SArfp 细胞株红色荧光表达率接近 100%，信号较强，体外用G418 筛选经过多次传代未见有荧光衰减趋势。本实验建立的乳腺癌骨移植瘤裸鼠模型及其荧光影像分析研究，具有以下优点：①敏感性：RFP 激发波长长，敏感性高，抗干扰能力优，穿透力强，利用它建立的可视化肿瘤模型效果，与其他几种成像模式（X 射线、CT、超声、磁共振、核医学）相比有更高的敏感性[8]，本实验中活体荧光成像自注射细胞起就能持续看到荧光的表达，而肉眼要到第3 周才能观察到肿瘤；②直观性：实验中只需将动物置于活体荧光成像系统下观察，即可见肿瘤生长的部位、大小；③连续性：传统的动物实验方法需要在不同的时间点牺牲实验动物以获得数据，得到多个时间点的实验结果。相比之下，利用活体荧光成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，直接观察肿瘤的生长及跟踪肿瘤的转移，使实验有很好的连续性，所得的数据更加真实可信，而且大大减少了实验所需的动物数量；④准确性：本实验中，IVIS 系统可以对荧光信号的强度进行量化处理，从而可以进行定量分析比较，提高结果的准确性。

本实验中还将活体荧光成像的数据和肿瘤体积测量、X 线片、组织学检查结果进行了分析比较，发现肿瘤生长体积、骨质破坏程度与乳腺癌细胞在体内的生长情况有较好的相关性。由于 X 线片能够直观地反映肿瘤细胞对骨质的破坏，组织切片能在细胞水平看到肿瘤细胞与骨组织的相互作用，三者的相互结合能够从不同的层面反映肿瘤发生和发展的过程，得到全面的、准确的数据，这对肿瘤的早期诊断和早期治疗研究及抗癌药物的疗效评估有重要的意义。

尽管活体成像技术具有灵敏度高、操作简单、结果直观等优点，但是也存在一些问题，比如在成像过程中，有些细胞（如血红蛋白等）会发出其自身的荧光，干扰观察结果。本实验中，第 4、5 周观察时，肿瘤体积相对较大，但表达荧光的肿瘤细胞仍在组织深处，所以检测到的荧光强度相对偏弱，在第 6、7 周时，肿瘤细胞生长至皮肤表浅处，荧光信号相对较强，与肿瘤体积相一致。有研究指出，利用荧光素酶标记的生物发光技术，在活体成像系统下有较强的穿透力，并能排除干扰信号，或许能弥补荧光蛋白发光的此项不足[19]。

综上所述，本实验成功建立了可非侵入性监测的乳腺癌裸鼠骨移植瘤模型，可利用活体荧光成像技术对乳腺癌细胞在骨环境内的生长情况进行直观、连续和定量的观察及分析，为抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):164-170

Non-invasive monitoring of the growth of breast cancer cells in bone environment using the optical imaging system

YAN Wei, JIN Fang-chun, FAN Qi-ming, TANG Ting-ting

ObjectiveTo establish the xenograft tumor model with human breast cancer cells MDA-MB-231SArfp stably expressing red fluorescent protein (RFP) and monitor the growth of breast cancer cells in bone environment using thein vivoimaging system.

MethodsMDA-MB-231SArfp cells were injected intra-tibially into BALB/c-nu female nude mice.The tumor cells growthin vivowas monitored by thein vivoimaging system and tumor volume were measured every week.Seven weeks after intra-tibial inoculation, the mice were sacrificed and hind limbs were taken out for the radiographic and histological analysis.

ResultsThe results examined by thein vivoimaging system showed that the MDA-MB-231SArfp cells started rapid growth at the 3 weeks after inoculation and the changes of fluorescent intensity correlated well with the increased tumor volume.X-ray images and HE stained tissues demonstrated that MDA-MB-231SArfp cells induced more severe osteolytic lesions at the 7 weeks than 4 weeks after inoculation.

ConclusionsWe successfuly established the non-invasive monitoring xenograft animal model using breast cancer cells labeled by the red fluorescent protein.Thein vivoimaging system, combined with radiographic and histological analysis, could provide a visualized, continuous, and reliable platform to monitor the growth of breast cancer cells in bone environment, which can used to screen and evaluate the new anti-tumor drugs.

Breast neoplasms; Disease models, animal; Diagnostic imaging; Photofluorography

TANG Ting-ting, Email: tingtingtang@hotmail.com

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(3):164-170

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.002

活体光学成像技术，包括生物发光与荧光成像技术，目前已成为医学、生物学及药物开发等研究领域发展最迅速的前沿技术。生物发光技术是以荧光素酶基因作为目的基因，将其转染至靶细胞或靶器官，观察时加入外源性荧光素底物，在转染细胞表达的荧光素酶的作用下，转变为可见光能释放，再利用活体光学成像系统检测[1-3]；荧光技术是采用荧光蛋白基团标记细胞，使细胞稳定表达荧光蛋白，之后利用激发光使荧光蛋白达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的光，最后通过活体荧光成像系统检测[4-10]。应用传统的检测方法（比如 X射线、放射性核素成像等）进行动物实验时，需要在不同的时间点处死实验动物以获得数据，缺乏连续性及整体性。相比之下，活体光学成像技术能直接监测活细胞在动物体内的生物学行为及跟踪分

国家自然科学基金（81172549）；上海市优秀学术带头人计划（11XD1403300）；上海教委重点学科建设基金（J50206）

200011 上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市骨科内植物重点实验室

汤亭亭，Email：tingtingtang@hotmail.com

2012-02-06子信号，是检测实验动物体内细胞及分子机制的强有力手段，在当前欧美等发达国家已被广泛地应用于感染、肿瘤免疫及治疗、基因治疗、自身免疫性疾病、药物开发等生物医学领域[8,11-14]。

Author Affiliation: Department of Orthopedic Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

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