黑曲霉发酵豆粕转化大豆异黄酮苷元的研究

李彦军， 马小燕， 毛跟年， 许牡丹， 张俊涛

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院, 陕西 西安 710021；2.陕西东大生化科技有限责任公司 蛋白与多肽研发中心, 陕西 西安 710000)

0 引言

大豆异黄酮苷元是大豆异黄酮存在的一种游离形式.与结合型的糖苷相比，苷元更利于肠道的消化吸收，且具有特殊的生理活性[1].经研究发现，大豆异黄酮不仅能够提高动物繁殖力，消除体内自由基、提高免疫力，而且还能显著地抑制霉菌毒素对动物肝功能和生长性能的影响[2,3].豆粕是饲料工业和畜牧养殖业中使用量很大的一种优质蛋白源，但豆粕中的大豆异黄酮主要以糖苷形式存在，不利于吸收.此外，豆粕中含有一些抗营养因子，对动物的肠道结构具有很大的破坏作用[4].通过微生物法发酵豆粕，不仅可以将豆粕中的大豆异黄酮糖苷直接转化为苷元[5]，而且还可以降解豆粕中存在的抗营养因子、多糖和蛋白质等，使其变成利于动物消化吸收的低分子糖、小肽和氨基酸，从而提高发酵豆粕在饲料中的利用价值[6].

本实验拟采用黑曲霉直接发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元，研究发酵条件对发酵豆粕中苷元含量的影响，旨在为豆粕的有效利用提供新的途径及参考.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

豆粕：东北榨油厂；黑曲霉 本学院微生物菌种室提供；染料木素和大豆苷元标准品 购于中国生物制品检定所；其他化学试剂均为分析纯.

Agilent1100型高效液相色谱仪，霉菌培养箱，安亭台式离心机等.

1.2 实验方法

1.2.1黑曲霉发酵豆粕

将活化后的黑曲霉扩大培养获发酵母种.将豆粕于121℃灭菌15min，冷却后加适量灭菌蒸馏水，搅拌均匀，接母种于30℃下发酵培养.

1.2.2发酵豆粕中大豆异黄酮苷元的提取

将发酵后的豆粕于80℃烘干，粉碎，按固液比1∶5加入70%乙醇，70℃回流提3h，微孔滤膜法过滤得一次提取液.

1.2.3大豆异黄酮苷元含量测定

采用高效液相色谱法[7]测定发酵豆粕一次提取液中大豆异黄酮苷元的含量.根据染料木黄酮和大豆苷元不同浓度下测得的峰面积和浓度，建立标准曲线方程，以二者的总量表征大豆异黄酮苷元含量.色谱条件：流动相：0～15min，15～40%甲醇的水溶液；15～40min，40～55%甲醇的水溶液；流速：0.6mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；检测波长：254nm.

1.2.4豆粕发酵条件的优化

研究豆粕粒度、基质含水量、接种量、发酵时间4个因素对黑曲霉发酵豆粕的影响，以发酵豆粕中的苷元含量为指标，确定最佳的发酵条件(其中每个因素重复5次，结果取平均值).

2 结果与分析

2.1 豆粕发酵前后大豆异黄酮苷元含量分析

采用HPLC法测定发酵前后豆粕一次提取液中的大豆异黄酮苷元含量，结果如图1、2所示.

图1 发酵前豆粕一次提取液HPLC谱图

图2 发酵后豆粕一次提取液HPLC谱图

由HPLC图谱可以看出，发酵前豆粕中的苷元含量极少，发酵后豆粕中苷元的含量大大增加了，说明黑曲霉发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元的方法是可行的.

2.2不同因素对黑曲霉发酵豆粕产大豆异黄酮苷元含量的影响

2.2.1发酵时间对发酵结果的影响

将一定量活化后的黑曲霉，接入灭菌豆粕中，调整含水量至75%，混匀后发酵，测定基质中苷元含量，以确定最适发酵时间，结果如图3所示.

图3 苔元含量随发酵时间的变化曲线

图4 接种量对苷元含量的影响

由图3可以看出，豆粕发酵48h后，发酵基质中大豆异黄酮苷元含量基本稳定，故确定最适发酵时间为48h.

2.2.2接种量对发酵结果的影响

将培养好的黑曲霉种子按不同接种量接入豆粕基质中，调整基质水分含量至75%，于30℃发酵培养48h，测定发酵基质中苷元含量，以确定最适接种量，结果如图4所示.

图5 豆粕粒度对苷元含量的影响

图6 基质含水量对苷元含量的影响

试验结果表明：接种量过小，黑曲霉接入豆粕后，由于延滞期过长，不利于β-葡萄糖苷酶的产生和大豆异黄酮糖苷酶解，会使发酵周期延长；增加接种量，有利于缩短延滞期，使菌体迅速生长.当接入的种子培养基达到即接种量为8%时，即可满足发酵的需求.

2.2.3豆粕粒度对发酵结果的影响

发酵基质颗粒大小能直接影响培养基的膨松程度及颗粒对水分的吸收，导致颗粒间传质不均，影响菌体生长.试验采用不同粒度的豆粕进行发酵，考察豆粕粒度对发酵结果的影响，结果如图5所示.

由图5可知，豆粕颗粒大小以40目为宜.粒度过大，菌体生长较差，菌丝无法深入豆粕颗粒内部，产生β-葡萄糖苷酶的能力较低，苷元产生量较少；颗粒过小，基质易结团，透气性差，不利于菌体生长，也会导致大豆异黄酮苷元产量偏低.

2.2.4基质含水量对发酵结果的影响

黑曲霉种子培养基按豆粕质量的8%接种，将基质含水量分别调整为50%、60%、70%、75%、80%和85%，于30℃条件下发酵培养48h，考察基质含水量对苷元含量的影响，结果如图6所示.

由图6可知，基质含水量为70%时，发酵后的豆粕基质中总异黄酮苷元含量最高.若含水量太少，菌体生长可利用的活性水不足，菌体生长不良，不利于大豆异黄酮糖苷的转化，苷元含量偏低；含水量太多时，可出现游离水，基质易结团，透气性差，不利于黑曲霉生长，菌体产酶量下降，总异黄酮苷元产量也会偏低.

2.3 发酵条件的正交实验优化

采用L9(34)正交实验对黑曲霉发酵制备大豆异黄酮苷元进行了研究，以异黄酮苷元产量为指标进行试验优化，结果如表1、2所示.

表1 大豆异黄酮苷元含量的正交试验结果

表2 方差分析表

由正交试验方差分析可知，采用黑曲霉固态发酵转化大豆异黄酮苷元时，发酵时间影响显著，其次为豆粕粒度、水分含量、接种量.由极差分析可知，采用黑曲霉固态发酵转化大豆异黄酮苷元，最佳发酵条件为：豆粕粒度40目，基质含水量75%，接种量为8%，30 ℃下发酵48 h，在此条件下发酵豆粕中苷元含量可达425.0 mg/100 g豆粕.

3 结束语

采用黑曲霉发酵的方法能够使豆粕中的大豆异黄酮糖苷转化为苷元，制备工艺简单，苷元含量高，有利于发挥大豆异黄酮的生物活性，提高豆粕的利用价值.

试验在黑曲霉的适宜生长温度30 ℃下，以大豆异黄酮苷元含量为指标，分别考察了发酵时间、接种量、豆粕粒度、基质含水量对发酵豆粕中苷元含量的影响，并通过正交试验，确定了黑曲霉发酵制备大豆异黄酮苷元的最佳工艺，为进一步规模化生产提供依据.

[1] KUDOU S，SHIMOYAMADA M. A new isotlavoae glyeosidein soybean：seeds(Glycine max Merriu)，glycitein，T-O-β-(6″-0-acety1)-glucopyranosidc[J]．J Agric Bio Chem,1991，55(10)：859-860．

[2] 宋 凯.大豆异黄酮的生理功能及其对畜产品品质的影响[J].饲料博览,2008,24(7)：5-7.

[3] 陈宝江. 大豆异黄酮作用机制及在动物生产中的应用[J]. 动物科学与动物医学,2003，20(10):53-55.

[4] 张道银.豆粕的质量控制[J].粮油食品科技，2001，9(1)：35-36.

[5] 井乐刚，张永忠．微生物发酵制备大豆异黄酮的研究进展[J]．微生物学通报，2003，30(2)：86-88.

[6] 蔡 晶，王 影.固态发酵豆粕在饲料中的研究应用[J].中国新产品新技术，2009，9(19)：137.

[7] 王 松,丁 立,周荣琪. HPLC 法测定豆粕中大豆异黄酮的含量[J].化工进展,2005,24(2):196-199.