双污泥反硝化聚磷系统污泥的培养与驯化

史 静，吕锡武，张怀玉，杨子萱

（东南大学 能源与环境学院，南京210096）

双污泥反硝化除磷工艺是用厌氧／缺氧环境来代替传统的厌氧／好氧环境，驯化培养出一类以硝酸根为最终电子受体的反硝化聚磷菌（denitrifying phosphorus removing bacteria，DPB），通过反硝化除磷菌和硝化菌的代谢作用同时脱氮除磷［1］。该技术解决了传统生物脱氮除磷工艺中碳源不足，泥龄矛盾，氮磷处理效率难以同步提高等问题［2－3］，逐渐成为污水生物处理技术领域研究的热点。

反硝化除磷污泥和硝化污泥的成功培养和驯化是双污泥工艺稳定运行的前提。硝化污泥是化能自养菌，其生长需要充足的溶解氧，需要保证好氧条件和一定的碱度。对于聚磷菌，主流存在2种说法：一类菌属说［4］和两类菌属说［5］。一类菌属说指系统中指存在一类聚磷菌，它们在一定程度上具有反硝化能力，关键在于厌氧／缺氧这种交替运行的环境条件是否得到了强化，只有给聚磷菌创造特定的厌氧／缺氧交替环境诱导出其体内具有反硝化作用的酶，才能使其具有反硝化能力［6］。两类菌属说是指聚磷菌可以分为两大类，一类仅能利用氧气作为电子受体，另一类则既能利用氧气又能利用硝酸盐作为电子受体。无论哪种假说，反硝化聚磷菌的生长都与好氧聚磷菌的生长以及厌氧／缺氧条件的强化密切相关。

基于上述理论，并考虑在不影响反硝化聚磷菌生长的情况下尽量抑制其主要竞争者聚糖菌和反硝化菌的生长，试验采取低碳高磷进水、两阶段的运行方式进行反硝化聚磷污泥的培养，并在硝化污泥和反硝化聚磷污泥成功培养后采用厌氧／缺氧／硝化－序批 式 反 应 器 （anaerobic／anoxic／nitrification－sequencing batch reactor，A2N－SBR）工艺对其脱氮除磷效果进行了试验。

1 试验材料与方法

1.1 试验装置

采用SBR反应器进行污泥培养，装置均采用PVC材料制作，反硝化聚磷污泥培养池和硝化污泥培养池的容积分别为75L和120L。A2N－SBR试验中，厌氧／缺氧SBR池 （anaerobic／anoxic－sequencing batch reactor，A2－SBR）和好氧硝化SBR池（nitrification－sequencing batch reactors，N－SBR）的有效体积均为65L。试验中不同状态的转换通过时间控制器控制，采用加热棒进行温度控制，温度为20～28℃。

1.2 污泥驯化方法和运行方式

反硝化聚磷接种污泥和硝化接种污泥均取自南京市某污水处理厂氧化沟。污泥驯化采用人工配水，通过投加乙酸钠、葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾、碳酸氢铵、硝酸钾和碳酸钠改变进水水质。

反硝化聚磷污泥驯化分为2个阶段，第1阶段为好氧聚磷污泥的培养阶段，运行方式为厌氧4.5h，好氧4.5h，沉淀2.0h，进出水1.0h，周期为12.0h。进 水 COD、TN 和 SP 分别为200、10、20～35mg·L－1。运行约40d，即80周期。好氧阶段气水比为12∶1。

第2阶段为反硝化聚磷污泥的培养，运行方式为厌氧4.0h，缺氧4.5h（其中硝酸盐进样0.5h），好氧0.5h，沉淀2.0h，进出水1.0h，周期为12.0h。好氧阶段气水比为12∶1。厌氧阶段进水量为50L，缺氧阶段硝酸盐进样量为10L，在分析和讨论中此阶段的进水磷浓度、厌氧释磷量以及其他浓度均为容积为60L的折算浓度。进水COD、TN和SP分别为120、10、20～35mg·L－1。硝酸盐在缺氧初始采用连续投加的方式，进样时间为0.5h，投加浓度为30～50mg·L－1，投加浓度随周期逐渐增加。运行约60d，即120周期。

硝化污泥驯化运行方式为好氧9.0h，沉淀2.0h，进出水1.0h。好氧阶段气水比为15∶1。进水COD、氨氮和SP浓度分别为80、30～50、3mg·L－1，碱度为250～350mg·L－1。氨氮投加浓度随周期逐渐增加。运行约100d，即200个周期。

1.3 水质指标与分析方法

水质指标采用国家环保总局颁布的标准分析方法进行测定［7］。CODcr：重铬酸钾法；氨氮：纳氏试剂分光光度法；NO3－－N：紫外分光光度法；PO43－－P：钼锑抗分光光度法；NO2－－N：N－（1－萘基）－乙二胺光度法。

1.4 荧光原位杂交（fluorescence in－suit hybridization，FISH）分析

1.4.1 玻片的处理 玻片用热肥皂水刷洗，1%的HCl浸泡24h，高温灭菌20min；用1%的HCl煮沸10min，烘干；载玻片放入APES与丙酮的1∶50溶液（现用现配）1min，然后取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，置4℃下保存备用。

1.4.2 样品的采集与预处理 用经高温灭菌的聚乙烯管取活性污泥；加灭菌蒸馏水适量，震荡混匀，超声波处理使细菌分散；取清洗下来的悬浊液，按照1∶1加入4%的多聚甲醛，于4℃固定；固定样本用PBS 10 000r／min，离心漂洗3次；加PBS与乙醇的1∶1溶液于－20℃下保存。

取10μL样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小；37℃烘箱热固定2h；依次用50%、80%、96%乙醇室温下脱水3min；室温下干燥。

1.4.3 杂交反应 所使用的探针包括硝化菌探针NIT3（CCTGTGCTCCATGCTCCG）和聚磷菌探针PAO651（CCCTCTGCCAAACTCCAG），上述探针5'端分别用FITC、Cy－3标记。探针浓度均为50ng／μL。硝化细菌杂交液为：40%去离子甲酰胺（DAF）、0.01%SDS、20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.9mol／L NaCl；PAO 杂交液为：0.9mol／L NaCl、20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.01%SDS、35%DAF。

密闭杂交盒底部放高压灭菌处理过的吸水纸，用杂交液浸润，使杂交环境保持一定湿度。每张带有样品的载玻片上加入24μL的杂交液和1μL探针，加盖硅化盖玻片，放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度为46℃，硝化细菌、PAO杂交反应时间分别为5、2h。

1.4.4 洗脱 将杂交后的载玻片从杂交盒中取出，放入48℃预热的杂交洗脱液中20min，室温下晾干。硝化菌洗脱液：20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.01%SDS、5mmol／L EDTA、60mmol／L NaCl；PAO洗脱液：20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.01%SDS、5mmol／L EDTA、70mmol／L NaCl。

1.5 扫描电镜观察硝化污泥和反硝化聚磷污泥

取样沉淀去上清液，样品在2.5%的戊二醛中4℃固定，离心去上清液；加入0.1M，pH＝7.0的PBS缓冲溶液，分散均匀并离心漂洗3次。用浓度梯度分 别 为 30%、50%、70%、85%、95%、100% 的乙醇梯度脱水；真空干燥；用导电胶将干燥后的样品粘在样品台上，放入离子溅射仪中镀金膜；采用型号为JSM－6360LV 扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）进行观察和拍照。

2 结果与讨论

2.1 好氧聚磷菌的富集和驯化

反硝化聚磷污泥培养第1阶段的主要目标是富集驯化PAOs。为了减少聚糖菌（glycogen－accumulating organisms，GAOs）对PAOs富集的影响，采用进水高磷浓度培养的方法。GAOs同样适宜生长于厌氧／好氧交替运行的环境，其代谢过程与PAOs相似，但并不发生磷的释放和吸收［8］。有研究表明［9－13］：在低碳磷比条件下，污泥的含磷量明显升高，有利于聚磷菌生长，高进水碳磷比则有利于聚糖菌的生长。因此采取进水高磷浓度的方式富集PAOs同时抑制GAOs的生长。

培养第1阶段从第12周期开始对进水、厌氧结束、好氧结束和出水的磷浓度进行测定。第17周期出现了污泥发黑、沉降性能差的现象，因此进行了少量排泥，并在第18～21周期减少进水COD至75～100mg·L－1，第22周期后恢复正常进水浓度。

从图1可知，在进水高磷浓度的培养条件下，污泥在前36周期为“适应”阶段。虽然有释磷和聚磷现象，但释磷和聚磷量较小，释磷量、聚磷量、除磷量（除磷量＝进水磷浓度－出水磷浓度）分别为2.6～7.5、6.0～18.4、0.8～12.2mg·L－1。第36周期后出现了明显的释磷和聚磷现象，且释磷和聚磷量均具有上升的趋势（如图2所示），最大释磷量、聚磷量和除磷量分别为77.2、89.4、25.0mg·L－1，聚磷量与释磷量之比基本保持在1.2～1.4，实现了强化生物除磷系统希望达到的理论值。

图1 好氧聚磷污泥培养过程中各阶段水中磷浓度随周期的变化

图2 好氧聚磷污泥培养过程中释磷量、聚磷量和除磷量随周期变化

在第1阶段培养结束后对一周期的释磷、聚磷情况进行了监测，磷变化曲线如图3所示。进水、厌氧结束、好氧结束和沉淀结束的磷浓度分别为24.1、100.1、2.98、4.37mg·L－1。释磷量、好氧聚磷量和除磷量分别为76、97.12、19.7mg·L－1。厌氧段初始15min释磷速率最大，为2.55mg·L－1·min－1，初始15min的释磷量约占总释磷量的50.3%。分析认为：在上一周期的好氧过程中，PAOs不断氧化分解体内储存的聚 β 羟基丁酸酯（poly－β－hydroxybutyrate，PHB）等释放能量并过量摄取污水中的磷，污泥处于“饥饿”状态，且厌氧初始的有机底物浓度最大，使聚磷菌将有机物转化为体内PHB和释磷的驱动力最大，因此具有最大的释磷速率。好氧聚磷阶段为270～540min，在480min处基本完成聚磷，聚磷速率采用一级动力学方程。即：

图3 好氧聚磷污泥培养末期一周期磷变化曲线

图4 好氧聚磷过程一级反应线性拟合

2.2 反硝化聚磷菌的富集和驯化

第2阶段的主要目标是富集驯化DPB。考虑到在缺氧阶段需投加硝酸盐，反硝化菌可在利用厌氧阶段剩余碳源进行反硝化，与DPB竞争硝酸盐［14－15］，此外有研究表明碳源和硝酸盐同时存在时对反硝化除磷产生不利影响［16］，较低的C／N适合反硝化除磷，因此第2阶段的培养减少进水碳源量。同时缺氧段投加硝酸盐采取逐渐加量的方式，防止培养初期硝酸盐在缺氧段不能完全消耗，将剩余的部分硝酸盐带入下一周期。

第2阶段从第12周期开始对进水、厌氧结束、好氧结束和出水的磷含量进行测定，测定结果如图5、图6所示。第2阶段释磷量、缺氧聚磷量和除磷量为13.3～39.2、28.6～54.0、7.6～29.4mg·L－1。由于减少了进水的碳源量，与第1阶段相比，这一阶段释磷量和聚磷量没有第1阶段末期大，但除磷量基本维持在20mg·L－1左右，平均为19.3mg·L－1，与第1阶段末期除磷量相近。缺氧聚磷量占总聚磷量的百分比具有上升的趋势，说明污泥利用硝酸盐作为电子受体的反硝化聚磷能力逐渐上升。同时在测定中还发现，缺氧结束和沉淀出水中会存在亚硝酸盐，浓度范围分别为0.0～3.6、0.0～5.0mg·L－1。

图5 反硝化聚磷污泥培养过程中各阶段水中磷浓度随周期的变化

图6 反硝化聚磷污泥培养过程中缺氧聚磷量占总聚磷量百分比变化

在第2阶段培养结束后对一周期的磷和硝酸盐的变化进行了监测，变化曲线如图7所示。进水、厌氧结束、缺氧结束、好氧结束和沉淀结束的磷浓度分别为34.2、55.9、12.6、12.3、12.6mg·L－1。释磷量、缺氧聚磷量和除磷量分别为21.7、43.3、21.6mg·L－1，缺氧段初始30min具有最大的聚磷速率为1.19mg·L－1·min－1，是第1阶段最大好氧聚磷速率的69.6%。好氧聚磷和反硝化聚磷的主要区别为：以氧气作为电子受体消耗单位NADH2产生三分子ATP，而以硝酸盐为电子受体消耗单位NADH2产生两分子ATP，导致氧化单位NADH2所吸收的磷酸盐量（P／NADH2）不同［17－19］。因此，在聚磷段初始DPB和PAOs体内PHB均充足的情况下，缺氧聚磷速率较好氧聚磷速率低。

图7 反硝化聚磷污泥培养末期一周期氮磷变化曲线

缺氧段硝酸盐的总投加量为50mg·L－1，消耗量为33.9mg·L－1，平均单位硝酸盐的消耗量对应的除磷量为1.28（mg－P）·（mg－N）－1。出水的磷、硝氮浓度分别为12.6、16.9mg·L－1，但没有继续发生缺氧反硝化，同时好氧阶段也没有明显的聚磷现象，分析认为这时DPB胞内的PHB成为限制因素导致无法进一步聚磷。亚硝酸盐在360min处开始有明显的累积现象，此时聚磷基本完成，分析认为：亚硝酸盐为反硝化（聚磷）过程中的不完全反硝化（聚磷）产物或中间产物，有文献表明：亚硝酸盐在低浓度下可作为反硝化聚磷的电子受体［20］，因此在240～360min过程中产生的亚硝酸盐可作为电子受体进行反硝化聚磷，在360min之后DPB胞内的PHB耗尽不能进一步消耗亚硝酸盐，由此造成了亚硝酸的累积；另外好氧段曝气使吸附在污泥表面的亚硝酸盐吹脱入水中，也可能是造成亚硝酸盐的升高的原因之一。

在表观上可以看出，通过上述2阶段的培养污泥已经具有较强的释磷聚磷能力，故判断反硝化污泥培养成功。

2.3 硝化菌的富集和驯化

硝化菌是化能自养菌，硝化反应需要满足好氧条件并保持一定的碱度。从第12周期开始对进水、好氧结束和出水的氨氮进行测定，结果如图8所示。在首次测定时进水浓度为42.3mg·L－1，但出水氨氮高达15.3mg·L－1，因此降低了进水氨氮浓度，采取了逐步增加进水氨氮浓度的方法，取得了良好的效果。氨氮去除量由27.2mg·L－1逐渐增加到50.7mg·L－1，去除效率也由初始的64.3%上升并稳定在98.5%以上。

图8 硝化污泥培养过程中各阶段水中氨氮浓度随周期的变化

在硝化污泥培养结束后对一周期的氨氮和硝酸盐的变化进行了监测，如图9所示，在420min左右完成硝化反应，氨氮的去除和硝氮的生成基本符合零级反应。

图9 硝化污泥培养末期一周期氨氮、硝氮变化曲线

根据 Monod方程［21］和比硝化速率的物理意义，有其中：CNH3为t时刻的氨氮浓度；vmax，NH3为比硝化速率；Ks，NH3为 氨 氮 饱 和 常 数。有文献表明：Ks，NH3＝100.051t－1.158［22］，20℃时Ks，NH3＝0.7mg·L－1＜＜CNH3，氨氮以最大速度进行硝化反应，呈零级反应关系。对氨氮的去除进行曲线拟合得到vmax，NH3Cx＝0.1134mg／（L·min－1），将Cx＝2.76g／L带入，得到vmax，NH3＝0.002 4h－1，这与文献［19］中计算出的vmax，NH3＝0.002 2～0.003 1h－1相近。经过此阶段的培养在表观上可以看出污泥已经具有较强的硝化能力，故判断硝化污泥培养成功。

2.4 FISH及SEM分析

上述内容从表观上表明了双污泥培养成功，但仍未能定性判断是否存在大量的硝化菌和聚磷菌，因此进行了FISH检测并使用SEM进行污泥大致形态的观察。图10、图11分别为双污泥的FISH及SEM测定照片。从图片可以明显看出硝化污泥和反硝化污泥在各自的系统中已经大量存在。

图10 双污泥FISH图片

图11 双污泥SEM图片

从SEM照片可知，双污泥系统中均存在大量密实的菌胶团，丝状菌构成了菌胶团的主要骨架。从形态上来看，硝化菌胶团主要以椭球状和棒状的球菌或者短杆菌为主，宽度在0.5～1μm左右。反硝化聚磷污泥中细菌的形态更丰富，主要有球菌、双球菌、螺旋菌、短杆菌和长杆菌等组成。

2.4 A2N－SBR运行效果

反硝化除磷污泥和硝化污泥驯化成功后，采用A2N－SBR［23］工艺进行脱氮除磷试验。A2－SBR和N－SBR的有效体积均为65L，A2－SBR和NSBR进水前泥水混合物均约为15L，处理水量约为50L，容积交换比为0.70～0.77。如表1和图12所示，进水COD、氨氮、磷浓度分别为188.0、54.8、7.25mg／L时，去除率分别为98.6%、76.7%和94.1%，具有良好的脱氮除磷效果。

表1 A2N－SBR双污泥工艺各阶段对污染物去除效果mg·L－1

厌氧阶段反硝化聚磷菌碳源以PHB的形式储存在胞内同时释磷，COD去除量为157.2mg·L－1，占其总去除量的89.7%，释磷量为22.0mg·L－1。根据Ekenfelder提出的底物代谢速率遵循一级反应动力学的规律，则厌氧段DPB摄取碳源速率为：raacnaerobic可推导出Cac＝Cac0e－KacCxt。其中为厌氧状态下碳源的消耗速率；Cac为碳源浓度；Kac为碳源去除速率常数；Cac0为碳源初始浓度。

图12 A2N－SBR双污泥工艺脱氮除磷效果

E Murnleitner根据反硝化除磷原理和计量学推导出的模型［24］有：

由于存在容积交换比，在硝化段初始，磷、氨氮的浓度被稀释为38.0、23.9mg·L－1。氨氮硝化按照零级反应硝化率为100%，磷浓度维持不变，COD在此阶段也有少量的去除。硝化阶段结束后，将沉淀后的上清液由N－SBR转入A2－SBR，因此需再次考虑容积交换比，缺氧初始硝酸盐量被稀释为23.7mg·L－1，同时磷浓度也被稀释。由于在厌氧结束后部分泥水混合物（约15L）仍存在于A2－SBR中，这部分泥水混合物含有厌氧结束段的氨氮、COD和磷，因此在硝化液进入A2－SBR后即缺氧段初始氨氮和COD浓度升高，但磷同时受到容积交换的稀释作用，故磷浓度变化不大。反硝化聚磷基本在25min内完成，硝酸盐去除量和聚磷量分别为18.5、22.9mg·L－1。

对于缺氧速率反应动力学可与好氧聚磷进行对比。以下为E Murnleitner等提出的好氧聚磷动力学和缺氧动力学方程。

式（1）中由于在好氧状态下氧气充足，因此开关函数MO2为1，同理在缺氧条件下基本不存在，因此MO2为0。因此对比两式可以发现仅相差而与的反应级数应相同，需要注意的是两者的fpp和Cp不同，因此缺氧聚磷速度仍可以用一级反应动力学拟合，但速率常数不相同。拟合结果为Kp，NO3－＝0.74L／（g·h）。

与2.2中DPB培养阶段周期试验相比，聚磷时间、聚磷量和聚磷速率均有所减少，缺氧聚磷量占总聚磷量百分比仅为78%，分析认为这是由于试验中不同的限制因素引起的。如前所述，在DPB培养的周期试验中，缺氧末端PHB成为了反硝化聚磷的限制因素，而A2N－SBR试验和DPB培养周期试验中的释磷量相近，但超量聚磷量远远没有达到DPB培养周期试验中的超量聚磷量，同时好氧阶段发生了聚磷，说明DPB胞内的PHB在缺氧阶段并没有完全利用，缺氧聚磷量的减少时由缺乏硝酸盐引起的。从试验结果可知：N－SBR的硝化效率为100%，那么硝酸盐的缺乏的主要原因主要有两方面：1）污水在厌氧结束时由A2－SBR向N－SBR转入时稀释氨氮；2）污水在硝化结束时由N－SBR向A2－SBR转入时稀释硝酸盐。后者随着运行周期的增长可被解决：硝化沉淀后N－SBR中会存有上一周期的硝酸盐，可以减弱稀释作用。前者只有通过尽量提高容积交换比来达到，使更多的氨氮转入N－SBR进行硝化反应，同时可降低出水的氨氮浓度，但是容积交换比与污泥的沉降性能具有一定的关系，提高存在一定的限度，这方面还需要进一步研究。

3 结 论

1）采用2阶段的运行方式进行反硝化聚磷污泥的培养，第1阶段为厌氧／好氧的运行方式，采取高磷浓度进水抑制PAOs其竞争菌种GAOs的生长。此阶段最大释磷量、聚磷量和除磷量分别为77.2、89.4、25.0mg·L－1；第2阶段采用厌氧／缺氧／好氧的运行方式，通过减少碳源投加量抑制DPB竞争菌种反硝化菌的生长，缺氧聚磷量占总聚磷量的百分比上升至96%以上。

2）采取了逐步增加进水氨氮浓度的方法培养硝化菌，氨氮去除量由27.2mg·L－1逐渐增加到50.7mg·L－1，去除效率也由初始的64.3%上升至98.5%以上。

3）硝化速率和反硝化速率满足零级动力学方程，比硝化速率常数为0.002 4h－1；好氧聚磷速率和缺氧聚磷速率均满足一级动力学方程，速率常数分别是0.377、0.740L／（g·h－1）。

4）利用驯化培养成功的反硝化聚磷污泥和硝化污泥进行了A2N－SBR试验。在进水COD、氨氮和磷分别为188.0、54.8、7.25mg／L时，去除率分别为93.5%、76.7%、94.1%，驯化培养的双污泥具有良好的脱氮除磷效果。

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