茶鲜叶酶促氧化合成茶黄素研究

龚志华 李 徐 朱盛尧 陈 朵 肖文军，3

（1.湖南农业大学茶学系，湖南 长沙 410128；2.长沙和润茶业科技有限公司，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学植物资源工程系，湖南 长沙 410128）

茶黄素是由茶多酚、儿茶素及其衍生物氧化缩合而来的，且溶于乙酸乙酯呈橙黄色的一类物质，被誉为茶叶中的脑黄金［1］。目前已经发现并鉴定的茶黄素及其前导物共有15种，并一致认为茶黄素（TF）、茶黄素－3 没食子酸（TF－3－G）、茶黄素－3’－没食子酸酯（TF－3’－G）和茶黄素双没食子酸酯（TFDG）是4种主要的茶黄素［2］。由于茶黄素在稳定性以及抗过敏、防治心血管疾病等功能上远优于儿茶素，使得高茶黄素制品的市场需求旺盛且供不应求，这主要源于中国红茶茶黄素含量较低（≤0.7%）以及通过提取分离红茶茶黄素的方法来制备茶黄素等客观原因［3－5］。为提高制备茶黄素的原料基质的茶黄素含量，国内外学者采用茶鲜叶匀浆模拟发酵法、其它植物多酚氧化酶酶促发酵法以及微生物酶促发酵法合成茶黄素［6－10］，但由于受到茶叶生产季节、多酚氧化同工酶的多样性以及优势微生物菌种筛选的成功性小等原因的局限，酶促生物发酵制备茶黄素未能取得突破性进展。试验在前期研究的基础上，比较研究政和大白茶、秀红、碧香早3种茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的效率，优化筛选最优茶鲜叶原料酶促合成茶黄素工艺技术参数，旨在为茶黄素的高效制备提供技术支持与数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

茶鲜叶原料：根据预试验中对12种茶鲜叶酶促合成茶黄素的检测结果，选择湖南农业大学长安教学实习基地春季大叶种－政和大白茶、中叶种－碧香早、小叶种－秀红的一芽二叶茶鲜叶作为试验原料。

1.2 试剂与仪器设备

1.2.1 试剂

邻苯二酚、柠檬酸、冰乙酸、磷酸氢二钠、石英砂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙腈：色谱纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；

乙酸乙酯：色谱纯，天津市津科精细化工研究所；

N，N－二甲基甲酰胺：色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心；

甲醇：色谱纯，上海振兴化工一厂。

1.2.2 仪器设备

电子天平：FAZ104S型，上海精科科学仪器有限公司；

组织捣碎匀浆机：FS－1（YQ－3）型，上海浦东物理光学仪器厂；

台式高速冷冻离心机：TDL5M 型，长沙英泰仪器有限公司；

大容量常温离心机：DD5型，长沙英泰仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：HH 型，金坛市金城国胜实验仪器厂；

紫外分光光度计：UV－2100型，北京莱伯泰科仪器有限公司；

高效液相色谱仪：LC10AT－VP Plus型，日本岛津公司；

鼓风干燥箱：DHG－9240A 型，上海一恒科技有限公司；

干燥机：XMY 型，上海市实验仪器总厂；

超声波清洗机：KQ－100 型，昆山市超声波仪器有限公司。

1.3 试验设计与方法

1.3.1 试验设计 试验设计见图1。

图1 试验设计图Figure 1 The design of the test

1.3.2 方法

（1）酶促氧化反应底物制备：称取政和大白茶、碧香早、秀红的茶鲜叶各2g，分别加入45mL预冷pH 4.8柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液，组织匀浆5 min后，立即沸水浴钝化酶活3～4min。冷却，转入离心管，常温下于4 000r／min离心15min，将离心后的上清液定容至100mL，检测儿茶素含量，作为酶促反应底物备用。

（2）酶液制备：称取政和大白茶的茶鲜叶0.12g，加入少许缓冲溶液及石英砂研磨成浆，4℃下于4 000r／min冷冻离心15min，取上清液定容至15mL，放入4 ℃的冰箱，作为酶源备用。

（3）酶促氧化反应：将以上制备好的反应底物分别移入100mL三角瓶中，放入30 ℃的水浴锅中预热10min，然后用移液管移取5mL酶液于三角瓶中，摇匀，90min后沸水浴终止反应，取10mL反应液检测儿茶素和茶黄素含量。

（4）酶促氧化合成茶黄素的最优茶鲜叶原料筛选：以春季政和大白一芽二叶茶鲜叶匀浆液为酶源，以单位质量茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的量为考察指标，比较研究政和大白茶、秀红、碧香早3种茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的效率以及各原料在酶促反应前后的儿茶素变化，筛选酶促氧化合成茶黄素的最优茶鲜叶原料。

（5）最优茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的单因素试验：以春季政和大白一芽二叶茶鲜叶匀浆液为酶源，以单位质量最优茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的量为考察指标，依次研究酶促反应体系pH 值、温度、时间、酶源用量4个因子对合成茶黄素的影响；各因素的水平设置见表1。

表1 单因素试验因素水平表Table 1 The level of single factor test

（6）最优茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的正交试验：根据单因素试验结果，以单位质量最优茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的量为考察指标，选择影响显著因素及其合理水平进行正交试验，优化最优茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素的工艺技术参数。

（7）最优正交组合的验证性实验：对正交试验中所得的最优组合进行3次验证性实验，验证所得实验结果的准确性与稳定性。

1.3.3 检测方法

（1）茶黄素检测方法：参照文献［11］。

（2）儿茶素检测方法：参照文献［12］。

2 结果与分析

2.1 酶促氧化合成茶黄素的最优茶鲜叶原料筛选

不同品种茶鲜叶原料作为底物对合成茶黄素的影响见表2。由表2可知，茶黄素合成总量（TFs）以政和大白茶的最多，其次为碧香早、秀红，同时，不同品种茶鲜叶合成茶黄素的各个单体含量存在差异。以碧香早为底物，合成的茶黄素中TF、TF－3－G占主导地位；而以政和大白、秀红作为底物合成的茶黄素中，TF、TF－3－G、TFDG 合成量相当，TF－3’－G相对较少。这与茶黄素合成的过程中实际消耗的儿茶素种类有关系。

表2 不同茶树品种鲜叶原料对合成茶黄素的影响Table 2 Effect of fresh leaves of tea varieties on synthesizing theaflavins／（mg·g－1·Fresh Leaves）

由表3可知，政和大白茶鲜叶原料反应后EGCG、EGC、EC、ECG 含量减少，而DL－C、GCG 的含量增加；秀红茶鲜叶原料反应后EGC、EC 也减少，其它儿茶素各单体均增加；碧香早茶鲜叶原料反应后EGC、DL－C、EC、ECG 含量减少，GCG 增加。同时，单位质量政和大白茶和秀红鲜叶的EGCG、ECG、EGC、EC 含量显著高于碧香早。因此，EGCG、ECG、EC含量较高的茶鲜叶品种原料有利于合成茶黄素。这主要是由于茶黄素类化合物是由成对的儿茶素经过多酚氧化酶催化形成邻醌，B环上有2个邻位羟基的简单儿茶素（L－EC，L－EGC）与B 环上有3个邻位羟基的没食子儿茶素（L－ECG 和L－EGCG）共同存在时，它们氧化后的邻醌B环之间可缩和形成茶黄素［12］。因此，选择政和大白茶鲜叶作为后续酶促氧化合成茶黄素的最优茶鲜叶原料。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 酶促反应体系pH 值对合成茶黄素的影响 由图2

表3 不同茶树品种鲜叶原料反应前后儿茶素的变化Table 3 Change of catechins in reacting system of different tea fresh leaves／（mg·g－1·Fresh Leaves）

可知，随着pH 的增加，茶黄素各个单体及其总量均呈现出先缓慢增加后减少的趋势，当pH 为5.0 时，各个单体及其总量均达到最大值。其中，TFDG 变化最为突出，大约减少了35.7%，其次为TF－3’－G。因此，pH 5.0是合成茶黄素的适宜pH 值。

图2 酶促反应体系pH 值对合成茶黄素的影响Figure 2 Effect of pH value in the reacting system on the systhsis of theaflavins

2.2.2 酶促反应体系温度对合成茶黄素的影响 由图3可知，当反应体系的温度从20 ℃上升至30 ℃时，茶黄素各个单体的量及其总量均大幅增加，这说明在一定温度内，随着温度的上升，多酚氧化酶的活性增强，酶促氧化合成茶黄素的量增加；当温度上升至30 ℃后，TFs、TF、TF－3－G 及TF－3，－G 的合成量开始下降；当温度上升至40℃后，茶黄素各组分合成量均逐渐降低。

图3 酶促反应体系温度对合成茶黄素的影响Figure 3 Effect of temperature in the reacting system on the systhsis of theaflavins

2.2.3 酶促反应时间对合成茶黄素的影响 由图4可知，随着酶促反应时间的延长，茶黄素的合成量先逐步增加，当反应进行到120min时，单位质量茶鲜叶酶促合成茶黄素的总量达到最大值，随后茶黄素的合成总量开始下降。

2.2.4 酶源添加量对合成茶黄素的影响 由图5可知，酶源添加量在0.2～0.6g／100mL时，反应体系中茶黄素的合成总量随酶源添加量而逐渐增加，其中TF的合成量增加明显，当酶源添加量在0.6～1.0g／100mL 时，各茶黄素组分的合成量无明显变化，而茶黄素总量有逐渐下降的趋势，这可能是茶黄素在酶的作用下，进一步氧化聚合成茶红素的缘故［13］。

图4 酶促反应时间对合成茶黄素的影响Figure 4 Effect of enzymatic reacting time on the systhsis of theaflavins

图5 不同酶源添加量对合成茶黄素的影响Figure 5 Effect of adding enzyme amount on the systhsis of theaflavins

2.3 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，以政和大白春茶为原料，选择酶促反应体系pH 值、反应时间、反应温度、酶源添加量4个因素，设置4因素3水平L9（34）正交试验（表4），试验结果见表5。

表4 正交试验设计表Table 4 Orthogonal test design

由表5可知，在酶促反应体系pH 值、反应时间、温度、酶源添加量4个影响因子中，对TFs影响大小的顺序依次为B＞D＞A＞C，结合茶黄素总量的均值、极差分析结果，可以看出酶促合成茶黄素的最佳组合是B2D2A3C3，即反应时间为120min、酶源添加量为0.6g／100mL、pH 值为5.2、反应温度为35 ℃。

表5 酶促合成茶黄素的正交试验结果与分析Table 5 Results of orthogonal test of enzyme synthesizing theaflavins

2.4 最优组合验证性实验

对获得的最优工艺技术组合A3B2C3D2进行3 次验证性实验。结果表明，3 次验证试验的茶黄素合成量分别为2.73，2.70，2.74mg／g·鲜叶，平均为2.72mg／g·鲜叶，说明所得工艺技术组合具有很好的重复性和准确性。

3 结论

试验结果表明，政和大白茶、秀红、碧香早3种茶鲜叶原料在酶促氧化合成茶黄素的效率上存在较大差异，其中以政和大白茶鲜叶原料合成茶黄素的总量最多，最适合于酶促氧化合成茶黄素，这主要是由于3种茶鲜叶原料的儿茶素组成及其含量不同所致。政和大白茶鲜叶原料酶促氧化合成茶黄素最优工艺技术参数：酶源用量为0.6g酶液／100mL，酶促反应时间为120min，反应体系温度为35 ℃，反应体系pH值为5.2。在该参数下，茶黄素的合成量达2.72 mg／g·鲜叶，说明所得工艺技术是一种利用茶鲜叶原料酶促氧化高效制备茶黄素的方法。

同时，试验过程中，由于酶促合成体系的量较小，酶促反应料液与空气接触充分，有充足氧供给，所以没有考虑通氧量的问题，但在工厂化酶促合成茶黄素的过程中，反应体系的体积量较大，反应料液很难与空气或氧气充分接触，将会影响酶促合成茶黄素的效率。因此，当工厂化酶促合成茶黄素时，尚需解决通氧的问题。

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